6种人兽共患病病原核酸液相芯片检测体系的建立

王 艳，沈家红，蒋 蔚，张磊萍，张 强，林颖峥，熊 炜，李树清

（1. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2. 上海市浦东新区动物疫病预防控制中心，上海 201299；3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

布鲁氏菌病（Brucellosis，以下简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）感染引起的一种全球分布的人兽共患病，主要影响感染宿主泌尿生殖系统，不仅会给畜牧业造成严重的经济损失，还会严重影响人类健康[1-2]。沙门氏菌（Salmonella）是一类人兽共患病原菌[3]，广泛分布于自然界中，其中鼠伤寒沙门氏菌是最常见的一种血清型，鼠类可以传播本病。弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）感染引起的一种高度流行的人兽共患病，可给畜牧业造成严重经济损失[4-5]。狂犬病是由狂犬病病毒属（Lyssavirus，LV）引起的一种高度嗜神经、人和动物都易感的烈性传染病[6]。汉赛巴尔通体（Bartonella henselae）是一种革兰氏阴性棒状短小杆菌，近年来在许多家养和野生哺乳动物中（包括家养犬、猫，野生猫科、犬科动物，啮齿动物和反刍动物）都已检测到[7]，人也可感染，因而备受关注。弯曲菌属（Campyolbacter）是20世纪70年代命名的一群革兰氏阴性微需氧的弯曲或螺形菌。研究表明实验动物肠道内也存在弯曲菌感染[8]。

本研究以布鲁氏菌、沙门氏菌、弓形虫、狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌这6种重要人兽共患病病原为对象，基于多重PCR技术的液相芯片检测体系，建立了能同时检测这6种病原的检测方法，并对其灵敏度、特异性等指标进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

链霉素-亲和素-藻红蛋白（SAPE）：购自美国Invitrogen公司；表面羧基化的荧光编码微球：购自美国Bio-Rad公司；Luminex 200液相芯片检测仪：美国Luminex公司产品；沙门氏菌（Sal）、布鲁氏菌（Bru）、弓形虫（Tox）质粒：由中国农业科学院上海兽医研究所友情馈赠；狂犬病病毒（Rab）、巴尔通体（Bar）、弯曲杆菌（Camp）质粒：由上海出入境检验检疫局动物检疫实验室保存。所有质粒均克隆在PUC57载体上；将制备的质粒采用双纯水配制成500拷贝/μL的浓度，−20 ℃保存备用。所有样品均为进出境实验动物拭子或全血样品。

1.2 方法

1.2.1 探针及引物的设计和合成 根据GenBank登录的沙门氏菌、布鲁氏菌和弓形虫基因序列，应用Primer 5.0序列分析软件进行序列分析、引物、探针设计，使探针的Tm值尽量保持在56～58 ℃，分别在探针的上下游设计特异性的扩增引物（表1）。引物、探针送上海生物工程有限股份公司合成。将引物用水溶解成200 mmol/L的贮存母液备用。

1.2.2 单对引物及多重引物扩增性能检测 将单对引物及多重引物，分别对多目的基因进行扩增，以鉴定引物的特异性。单重PCR反应配制为：10×buffer（Mg2+）2.5 µL、dNTP（2.5 mol/L）1.0 µL、引物 1.0 µL、模板 2.0 µL、HotstarTaq 0.5 U、ddH2O 18.5 µL，总 PCR 体系为 25 µL。多重 PCR引物加入量为：BruF1/R2 2.5 pmol，SalF1/R1 2.0 pmol，ToxF3/R5 1.0 pmol，RabF2/R1 2.0 pmol，BarF4/R2 2.5 pmol，CampF1/R3 1.0 pmol。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 20 s，35 个循环，72 ℃再延伸 1 min。反应结束后，取5 µL PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上行电泳检测。

表1 探针和引物序列

1.2.3 微球探针交联 取相应的荧光编码微球100 μL（表 2），5 000 r/min 离心 10 min 后弃上清，用双蒸水洗涤2次；用100 μL 0.1 mol/L pH6.0的MES重新悬浮后，加入0.2 nmol/μL的探针3 μL，充分混匀后，加入15% EDC，37 ℃避光孵育30 min；离心弃上清，用0.1% SDS洗涤2次，用50 μL TE缓冲液（pH8.0）重新悬浮后，4 ℃避光保存备用。

表2 探针名称及对应编码微球

1.2.4 杂交捕获检测 取PCR产物5 μL，加入微球溶液25 μL（每种微球按照2 000个/25 μL），充分混合均匀后，先94 ℃变性3 min，再50 ℃孵育30 min；接着加入 SA-PE（浓度 0.2 µg/µL）70 μL，继续孵育20 min；将Luminex 200加热板加热到50 ℃，并调整至度数状态。孵育结束后直接上机读取信号。根据Luminex公司推荐的判定标准，当每种荧光编码微球个数不小于20个，且背景空白荧光强度不高于300时，表明试验成立，可以进行结果判定。

1.2.5 探针特异性检测 按照每个反应25 μL体系，将6种微球混合，对每对单一引物进行杂交，以检测探针的特异性。

1.2.6 液相芯片检测体系建立 将特异性好的探针与多重PCR产物混匀杂交，设置仪器为同时检测6种荧光编码微球。取20份阴性样品，采用建立的液相芯片法进行检测，计算每种特异性检测微球平均荧光强度（Median fluorescent intensity，MFI）的均数和标准差，以均数+3倍标准差所得的值作为对应检测指标的cut-off值，确定阈值，高于cut-off值就视为阳性。

1.2.7 液相芯片检测体系特异性 提取其他方法确定为阳性的沙门氏菌、布鲁氏菌、弓形虫、狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌、小鼠肝炎病毒（MHV）、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、仙台病毒（SeV）、小鼠肺炎病毒（MPV）的DNA，并以此作为PCR扩增模板，用建立的液相芯片法进行杂交检测。

1.2.8 液相芯片检测体系灵敏度 将Bru、Sal、Tox、Bru、Rab、Camp质粒DNA分别依次进行5、10、50倍稀释，并分别作为PCR扩增模板，用建立的液相芯片检测体系进行检测。

2 结果

2.1 单对引物及多重引物扩增性能检测

电泳结果（图1）显示，单对引物和多重引物均能特异性扩增目的基因，表明引物具有良好的特异性。

图1 引物扩增性能的检测结果

2.2 探针特异性检测

6种微球对单一引物扩增产物的杂交检测结果如表3。数据显示，混合的6种探针针对单对引物扩增片段能有效识别捕获，且每种探针对其余两种目的产物没有明显的非特异性杂交信号，其MFI均低于100。显示设计的探针序列针对6种扩增产物具有较好的特异性。

2.3 液相芯片检测体系建立

对用其他方法确定为阴性的20份样品，将经DNA抽提、PCR扩增后得到的PCR产物用于液相芯片检测，用液相芯片法测得MFI均数和标准差，计算出的阈值为91.55+3×9.83=112.04（表4）。

2.4 液相芯片检测体系特异性

特异性检测结果显示（表5），建立的液相芯片检测方法对 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp有特异性杂交反应，均为阳性，而与其他重要病原病毒质粒未产生杂交反应，表明该方法具有良好的特异性。

表3 探针特异性检测结果

表4 液相芯片检测体系阈值的确定

2.5 液相芯片检测体系灵敏度

采用以上确定的检测体系，对系列浓度模板进行检测。数据显示，所建立的液相芯片检测体系的检测灵敏度大致为50拷贝/反应（表6）。

3 讨论与结论

目前，上述6种人兽共患病的检测方法主要有血清学方法、细菌培养法、细胞培养法。这些传统的检测方法不但耗时费力，而且可能会延误疫情控制，造成更大的经济损失和人类健康危害。液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的，被誉为后基因组时代的芯片技术。它有机整合了有色微球、激光技术、高速数字信号处理和计算机技术，具有通量大、灵敏度高、用量少等优点。

表5 液相芯片检测体系特异性检测

表6 液相芯片检测体系灵敏度检测 单位：拷贝/反应

本研究利用液相芯片技术，建立了能特异性检测 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp等 6种病原的液相芯片检测方法。该检测方法能够对目标基因进行快速检测，检测灵敏度可达50拷贝/反应，特异性好。因此，本研究建立的高通量液相芯片检测方法，对布鲁氏菌、沙门氏菌、弓形虫，狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌6种病原的快速筛查提供了技术支撑。