氧化石墨烯-DNA纳米荧光探针用于检测牛奶中的三聚氰胺

常晨阳，常 凯，刘丽蓉，韦 伟，朱秀焕，刘 伟，魏艳霞

（1. 聊城检验检疫局，山东聊城 252200；2. 董家口港检验检疫局，山东青岛 266400；3. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

三聚氰胺（Melamine，C3H6N6）是一种重要的氮杂环有机化工原料，具有生物毒性，食用后能诱发肾衰竭并导致死亡，是一种禁止用于食品及动物饲料的化学物质[1]。三聚氰胺中氮含量高达66%，多出蛋白质氨基酸中氮含量的3～4倍，在乳制品中掺杂添加可虚假提高蛋白质含量。我国一直对乳制品实行严格的三聚氰胺监控，已制定了多个乳制品中三聚氰胺检测国家及行业标准（GB/T 22388—2008、GB/T 22400—2008、SN/T 3627—2013和SN/T 4479—2016等）。目前，最常用的三聚氰胺检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GCMS）和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[2]。高效液相色谱串联紫外或DAD检测器可直接检测三聚氰胺，而气质联用法需要对三聚氰胺进行衍生化处理（BSTFA+TMCS，99+1），增加处理过程；液相色谱质谱联用仪具有较高的检测灵敏度，在部分实验室主要作为确定阳性定量使用，但因仪器昂贵，限制了其在某些检测平台的广泛使用。为此，寻找高灵敏度、高选择性，适合快速现场筛选的新检测方法一直是三聚氰胺检测研究的热点。

纳米材料具有特殊的微观尺寸，可展现出介观、宏观物质所不具备的独特物理化学性能，自20世纪80年代末，便倍受关注并广泛应用，逐步发展为具有庞大分支的学科领域[3]。纳米荧光探针以纳米材料为载体，具有合成简单、经济、检测快速，以及无需复杂前处理过程、灵敏度高等特点，表现出传统检测技术无法比拟的优势，已被应用于多种物质的检测传感器中[4]。近年来，不断有将纳米探针用于三聚氰胺检测的报道[5-8]，但多数研究限于检测简单水相，尚未实现在食品安全检测领域的技术突破。氧化石墨烯（GO）作为一种新型纳米材料，具有独特的物理化学和光学性质，近年来在生物传感方面的应用越来越广泛[9]。本研究设计的低荧光复合物GO-DNA纳米荧光探针，利用氧化石墨烯纳米材料独特的猝灭效应，依据修饰近红外荧光染料的DNA分子和三聚氰胺分子同氧化石墨烯间相互作用的不同，在三聚氰胺存在的情况下，可检测到被猝灭荧光信号的恢复。其检测原理为，氧化石墨烯和标记荧光基团的单链寡核苷酸（DNA-Cy5）单独存在时，氧化石墨烯会吸附单链DNA，使得荧光染料靠近氧化石墨烯产生荧光共振能量转移FRET及电子转移PET，从而导致荧光猝灭[10]；而溶液中存在三聚氰胺时，由于三聚氰胺特殊的分子平面结构，与石墨烯间的分子作用力远强于石墨烯与DNA间的相互作用力[11]，导致三聚氰胺分子将DNA链从石墨烯表面竞争下来，使得修饰的荧光基团Cy5因远离石墨烯表面而使被猝灭的荧光得到恢复，在检测波长处能检测到荧光信号。荧光信号的大小与加入三聚氰胺的量在一定检测范围内存在正相关。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 氧化石墨烯（GO）：购自南京先丰纳米材料科技有限公司；所用核苷酸Cy5-DNA序列（5'-Cy5-GCTTTCACTA-3'）：由上海生物工程有限公司合成并经HPLC纯化；三聚氰胺标准品：购自德国Dr公司；三氯乙酸、Tris缓冲、NaCl、KCl、MgCl2等试剂：购自医药集团上海化学试剂公司；化学试剂：均为分析纯级别，未经其他处理直接使用；试验所用水：Mill-Q二次超纯水（18.2 MΩ·cm-1）。

1.1.2 仪器 透射电子显微镜（JEM-100CXΠ，JEOL，日本）；200 kV 高分辨透射电子显微镜（日本，JEM-2100）；pH-3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）；FLS-980 型荧光分光光度计（英国，Edinburgh Instruments Ltd）；高速离心机（日本日立 CF16RXⅡ）；电子天平（瑞士梅特勒ME303）

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制 三聚氰胺使用液的配制：取12.6 mg粉末溶于1 mL 50%的甲醇/水（v/v）溶液中，得到浓度为100 mmol/L的标准品溶液；Cy5-DNA链：根据HPLC纯化后的浓度，用Milli-Q水配制成10 μmol/L的母液备用。

1.2.2 GO-DNA纳米探针制备 将确定浓度的GO与100 nmol/L的荧光标记的Cy5-DNA链，25 ℃水浴环境下，在缓冲溶液（20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2）中混合后静置 10 min，将反应后的溶液离心（8 000 r/min，20 min）纯化处理，重新分散在二次水中，以GO浓度记为相应的探针浓度，将其放置于4 ℃冰箱储存。

1.2.3 GO 用量优化 将GO水溶液由初始浓度1 mg/mL改变为使用浓度0、2、3、5、8、10、15、20 μg/mL，然后分别与 100 nmol/L 的 Cy5-DNA混合10 min，测量荧光强度的猝灭程度。检测Cy5荧光信号的激发波长为648 nm，发射波长为665 nm，狭缝设置为2 nm。

1.2.4 恢复动力学 以优化浓度后的GO（8 μg/mL）和100 nmol/L 的Cy5-DNA合成探针后，加入浓度为500 nmol/L的三聚氰胺，37 ℃下孵育，然后测定不同时间的荧光恢复强度。

1.2.5 纳米探针荧光恢复 利用以上优化好的数据，取1 mL体系，在8 μg/mL的GO-Cy5-DNA复合物纳米探针中，分别加入不同浓度的三聚氰胺（0～3 000 nmol/L），37 ℃下孵育30 min后，测定加入不同浓度三聚氰胺对应的荧光恢复强度。

1.2.6 纳米探针特异性试验 纳米探针（8 μg/mL）与10 mmol/L葡萄糖、果糖、麦芽糖、赖氨酸、酪氨酸、苯胺分别在37 ℃下孵育30 min后测其荧光强度。

1.2.7 牛奶样品应用分析 所用牛奶直接从超市购买，并添加不同浓度的三聚氰胺。预处理步骤为：取1 mL牛奶与4 mL高纯水溶于10 mL离心管中，然后加入0.5 mL 1%三氯乙酸（m/m），超声处理10 min后，12 000 r/min离心5 min，上清液用二次水稀释到10 mL 后用1 mol/L的Na2CO3溶液中和至pH7，然后加入探针检测。

2 结果

2.1 纳米复合物电镜和AFM表征

图1-a 为透射电子显微镜（TEM）下氧化石墨烯的形貌，可见氧化石墨烯呈现单层的片状结构，尺寸为50～500 nm 。在DNA链吸附到石墨烯表层后（图2-b），氧化石墨烯载体的形貌大小及分散性基本没有变化；通过量子力学显微镜（AFM）表征氧化石墨烯的厚度，发现厚度为1.5 nm左右，而吸附DNA链后的GO-DNA复合物的厚度增加到4.0 nm左右，可以验证DNA链被成功吸附在氧化石墨烯表面，成功形成了纳米复合物。

图1 透射电子显微镜（TEM）图

2.2 GO-DNA探针检测体系性能评价

2.2.1 探针合成、GO 用量优化及探针的恢复动力学 不同浓度的GO与100 nmol/L的Cy5-DNA反应10 min 后，由测得的荧光数据可见，Cy5荧光强度随着GO浓度的增加而降低，当GO浓度为8 μg/mL时，荧光染料荧光基本被全部猝灭，因此选择 GO浓度为8 μg/mL合成探针。加入500 nmol/L的三聚氰胺后，检测37 ℃孵育下，体系在不同时间的荧光强度变化。根据数据可得，加入三聚氰胺后10 min内，体系就能快速响应，产生强的荧光信号。当反应时间达到30 min时，荧光强度达到最大，之后基本不发生变化，因此选择30 min作为测定探针荧光恢复的时间。

2.2.2 纳米探针荧光恢复 在纳米探针中加入不同浓度的三聚氰胺后，测定纳米探针对目标分子三聚氰胺的荧光恢复情况，做出荧光回复曲线（图2）。可见，随着三聚氰胺浓度的增加，荧光强度先呈现线性增长，随后增长缓慢，当三聚氰胺浓度达到约3 mmol/L时，基本达到最大荧光强度。数据分析显示，当加入的三聚氰胺浓度较低（90～1 500 nmol/L）时，荧光恢复曲线基本呈现线性，三聚氰胺浓度与荧光强度的线性拟合方程为y=280.6+9.35x，线性相关系数为 0.996。

图2 GO-DNA探针荧光恢复曲线

2.2.3 纳米探针特异性 为评价本研究设计的纳米探针检测的特异性，研究了牛奶制品中常见的葡萄糖、麦芽糖、果糖及与三聚氰胺有结构相似的赖氨酸、酪氨酸、苯胺等分子对目标物的干扰。试验证明，纳米探针能与低浓度的三聚氰胺特异性结合而产生较大的荧光恢复，而对高出几十倍浓度（10 mmol/L）的葡萄糖、果糖、赖氨酸、酪氨酸、苯胺几乎没有任何响应，说明纳米探针对三聚氰胺具有很好的选择特异性。

2.2.4 纳米探针检测牛奶中的三聚氰胺 牛奶基质相对于水相体系，主要是去除蛋白质类杂质对三聚氰胺检测的干扰，因此选用1%的三氯乙酸对牛奶进行了简单预处理，以沉淀牛奶中的蛋白质。通过在不同种类市售液态奶中添加500 nmol/L浓度的三聚氰胺进行检测加标回收，可见加标样品的回收率为93%～102%，且重复性良好（表1）。该探针对奶粉中三聚氰胺的检测低限可达30 nmol/L，远低于我国规定的奶制品中三聚氰胺含量不得高于1 mg/kg的要求，可应用于实际牛奶样品中三聚氰胺的检测，具有应用价值。

表1 样品及回收率测定结果

3 讨论

本研究设计的纳米复合荧光探针是基于GO对荧光染料的猝灭效应而建立的。研究证明，GO可以吸附单链DNA形成GO-DNA复合物，并通过π-π堆积及FRET效应，有效猝灭DNA 链端标记荧光染料Cy5的荧光。基于三聚氰胺分子六元环的平面结构推测，它可以和GO表面发生较强的相互作用。三聚氰胺的加入后，导致其与DNA在GO表面发生竞争，使DNA链从GO表面脱落进入溶液，因而可以检测到荧光恢复（图3）。具体地，选择一段长度为10 bp、Cy5标记的单链DNA序列，通过与GO吸附形成 GODNA复合探针，此时Cy5-DNA的荧光被有效猝灭，而加入三聚氰胺后，荧光将得到恢复，因而荧光信号强度与三聚氰胺量在一定检测范围内将成正比。

图3 GO-DNA纳米荧光探针检测三聚氰胺原理

本研究利用GO纳米材料独特的猝灭效应，根据修饰近红外荧光染料的DNA分子和三聚氰胺分子同氧化石墨烯间作用力的不同，设计出一种合成简单、选择性好的检测三聚氰胺的纳米荧光探针。该探针具有如下优点：一是在三聚氰胺存在的情况下，可检测到被猝灭荧光信号的恢复，属于"turnon"型，灵敏度高；二是使用到的荧光染料的激发和发射荧光光谱在近红外波段，具有低的样品基质背景干扰；三是可以检测牛奶中不同浓度的三聚氰胺，具有良好的应用性。