罗斯河病毒RT-LAMP检测方法的建立

袁向芬，冯春燕，吕继洲，吴绍强

（中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 100176）

罗斯河病毒（Ross River virus，RRV）属披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus），是一种虫媒性人兽共患病病原，目前主要流行于澳大利亚以及巴布亚新几内亚等南太平洋岛屿国家[1-2]。研究者已在40多种蚊子体内分离到RRV，其中包括伊蚊、库蚊等。除蚊子外，RRV的脊椎动物宿主主要为负鼠、袋鼠、小袋鼠等有袋动物和人类[3-5]。在澳大利亚，该病的平均年病例数量高达5 100例，约为其他所有虫媒病病例总和的10倍[6-7]。RRV虽不致命，却可导致多发性关节炎、肌肉痛、发烧及慢性关节痛等症状，并可持续发作数周，甚至数月，每年造成的经济损失可达500万美元。RRV偶尔还会引发大规模疫情，造成更大损失。如，2015年澳大利亚发现了9 800例RRV感染病例，是其他年平均值的两倍；2017年1—2月，维多利亚州发现了1 200例病例，是该地以往4年病例数的总和[8]。目前，针对RRV感染，尚缺乏有效的治疗方法及商业化疫苗，仅可通过蚊虫管理、及时监控等预防性措施进行防控。

我国目前也存在RRV。早在1997年，赵春生等[9]在海南省蝙蝠脑中分离出1株病毒，最终判定为RRV，提示海南省可能存在RRV自然疫源地[10]；2012年，叶绪芳等[11]对2005—2008年在贵州省采集的不明原因发热病例、病毒性脑炎病例以及健康人群的血液进行了RRV抗体检测，发现阳性率分别为2.94%、3.52%和1.15%，且抗体阳性病例数和分布县数呈逐年增加趋势，提示贵州省也存在RRV感染。另外，随着国际活动及贸易的不断扩大，我国往返澳大利亚的航班及船舶日益增多，每年均会从澳大利亚等地进口活体袋鼠及袋鼠皮张等相关产品，RRV极有可能经进境人员、易感动物及相关制品引入国内，因此我国亟须加强RRV监测和研究，做好技术储备。

目前，国外针对RRV的检测方法主要有病毒分离、血清学检测及分子生物学检测[12-16]。虽然病毒分离仍为金标方法，但耗费时间长，需细胞培养设备及专业人员。而血清学方法主要通过免疫捕获ELISA完成，在对蚊子等小样本进行检测时，易产生因病毒浓度低导致的假阴性问题。相比之下，基于核酸扩增的分子检测方法更为简单、灵敏、快速，且适用于微量样品中靶基因的检测[17-18]。本研究基于环介导等温扩增技术，建立了一种快速检测RRV基因的方法，同时与荧光定量RT-PCR及常规RTPCR方法[19]进行了比较，证实本方法灵敏度高、特异性强，无需特殊仪器及专业人员，可应用于我国RRV监测及研究。

1 材料与方法

1.1 材料

罗斯河病毒（RRV）E基因：通过全基因合成获得，由北京华大基因有限公司合成，用于方法的建立及灵敏度、特异性验证；西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）、登革热病毒（Dengue virus，DV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因组：均为本实验室保存；65份蚊子样品：采集自云南省，于本实验室保存。

PCR扩增试剂GoTaq®G2 Flexi DNA Polymerase、RNA体外反转录试剂盒T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System：购自Promega公司；RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit和胶回收试剂盒Gel Extraction Kit：购自Qiagen公司；RT-LAMP试剂盒：购自北京蓝谱生物科技有限公司；SYBR Green I：购自Invitrogen公司；DL 2 000 bp DNA Marker及琼脂糖粉：购自TAKARA公司。

环介导等温扩增实时浊度仪LA-320c：购自北京蓝谱生物科技有限公司；Veriti 96孔梯度PCR仪：购自ABI公司；LightCycler®480II 实时荧光定量PCR仪：购自Roche公司；电泳仪：购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 本研究以RRV保守的包膜蛋白基因E2为靶序列，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explore V5设计并筛选了一套引物（共6条引物）：1对外引物（F3/B3），1对内引物（FIP/BIP）及1对环引物（LF/LB）。另外在外引物上游F3的5'端引入T7启动子序列，与B3一起用于RRV反转录RNA标准品的制备。相关引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 反转录RNA标准样品制备 以全基因合成的RRV-E2质粒为模板，以含有T7启动子序列的T7-F3/B3为引物进行PCR扩增，参照RNA体外反转录试剂盒操作手册进行cRNA合成，用乙醇沉淀法洗涤产物3次，并用DNAse去除产物中残留的DNA模板，然后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。用Nanodrop对回收到的cRNA产物进行定量，并利用下面公式进行浓度换算：[ 6.02×1023× 浓 度 (ng/µL)×10-9] / (DNA 长度×340) = 拷贝/μL；将RNA 10倍系列稀释为1×100、1×101……1×108拷贝 /μL，分装后置于−80 ℃超低温冰箱内备用。

1.2.3 RNA提取 按照RNA提取试剂盒操作手册，提取实验室保存的65只蚊子RNA，用60 μL DEPC水洗脱，置于−80 ℃冰箱备用。

1.2.4 反应体系及反应条件 利用LAMP实时浊度仪，实时监测反应进程，主要对反应温度、引物浓度及反应时间进行优化。

1.2.5 特异性试验 按照优化好的反应体系及条件，以RRV E基因以及WNV、DV、JEV基因组为模板进行LAMP扩增，验证该方法的特异性。

1.2.6 灵敏度试验 以制备好的一系列cRNA标准品为模板，进行RT-LAMP灵敏度验证，同时用荧光RT-PCR及常规RT-PCR进行比较验证。

1.2.7 稳定性试验 分别以阴性样品以及1×102、1×104、1×106拷贝/μL的cRNA标准品为模板，用LAMP实时浊度仪进行检测，对每种样品分别设3个平行对照，记录浊度达到0.2时所对应的时间，据此计算变异系数，以验证该方法的稳定性。

1.2.8 样本检测 用建立的RT-LAMP检测方法，检测提取的蚊子RNA样本，并与荧光定量RT-PCR及常规RT-PCR检测结果进行比对分析。

2 结果

2.1 反应体系及条件确定

经过对反应温度、引物浓度及反应时间的优化，确定RRV RT-LAMP法的反应体系（25 μL）为：FIP（20 μmol/L）和 BIP（20 μmol/L）各 2 μL，F3（5 μmol/L） 和 B3（5 μmol/L） 各 1 μL，LF（20 μmol/L）和 LB（20 μmol/L）各 1 μL，2×Reaction Mix 12.5 μL[Tris-HCl（pH8.8）40 mmol/L、KCl 20 mmol/L、MgSO416 mmol/L、(NH4)2SO420 mmol/L、Tween20 0.2%、Betaine 1.6 mol/L、dNTPs 2.8 mmol/L]，Enzyme Mix 1.0 μL，RNA 1 μL，DEPC 水 2.5 μL。反应结果既可根据实时浊度仪记录的浊度曲线进行，也可在反应前于反应管内加入 1 μL 荧光试剂FDR，反应后直接通过颜色变化来判定反应结果，还可通过观察反应后是否产生白色沉淀来判定反应结果。优化的反应程序为：62 ℃恒温作用1 h。该程序既可在恒温水浴锅中进行，也可在金属浴及各种核酸扩增仪等仪器中进行。

2.2 特异性试验

特异性试验结果显示，本研究建立的LAMP检测方法仅与RRV E基因发生反应，与其他相近病毒无交叉反应，特异性良好（图1）。

图1 RRV RT-LAMP方法特异性分析

2.3 灵敏度试验

灵敏度试验结果显示，建立的RRV RT-LAMP检测方法的最低检测限为10拷贝/25 μL，与浊度法、染料法及沉淀法3种判定方法（图2），以及荧光定量RT-PCR法的灵敏度相同，但比常规RT-PCR的灵敏度高10倍（图3）。

图2 RRV RT-LAMP灵敏度分析

图3 RRV 荧光RT-PCR及常规RT-PCR灵敏度分析

2.4 稳定性试验

实时浊度仪记录的数据显示，浊度达到0.2时，强阳性样本及临界值样本反应时间的变异系数均小于5%，表明稳定性良好（表2）。

表2 RRV LAMP稳定性分析

2.5 样本检测

用建立的RRV RT-LAMP检测方法，对实验室保存的65份蚊子样本进行检测，在阴阳性对照成立的基础上并未发现阳性样品，与荧光定量RTPCR及常规RT-PCR的检测结果相同。

3 讨论

环介导等温扩增技术作为一种新型分子诊断技术，具有灵敏度高、特异性强等优点[20]，且仅利用简单的恒温水浴设备即可实现对特异性靶基因的高效扩增，因此在分子诊断领域拥有巨大潜力，已被广泛应用于病原微生物及物种鉴定、疫病现场检测、临床诊疗等研究领域[21-24]。已有国内专家推测，云南省附近可能存在RRV自然疫源地。RRV是一种虫媒介导的人兽共患病病原，其对人类具有潜在危胁。常规的RT-PCR检测方法灵敏度欠缺，而荧光定量RT-PCR成本较高且需要专业的仪器设备，因此都不适用于临床样本的大量筛查。本研究建立的RT-LAMP检测方法成本低廉、反应迅速、灵敏度及特异性良好，且可根据实际情况选择不同的结果判定方式，是一种理想的疫病筛查工具，可为RRV监测及预警提供技术支撑。

本研究对临床收集的65分蚊子样品的检测均为阴性，且与荧光RT-PCR及常规RT-PCR的检测结果相同，与目前国内并未在蝙蝠以外动物体内分离到RRV的报道现状相符。但因本研究搜集的蚊子样本多来自内蒙古、北京等地，所以需要今后在云南等易感地区做进一步监测。

另外，对于LAMP技术本身而言，最突出的不足在于易出现气溶胶污染所导致的假阳性。然而，普通LAMP法包含4条引物（1对外引物和1对内引物），针对靶序列的6个特异性位点设计而成，理论上应比仅有2条引物的PCR方法特异性更强，因此考虑 LAMP的假阳性多为其自身扩增产物开盖操作所致。由于LAMP产物浓度非常高，可达模板浓度的1010倍，因此极易产生气溶胶污染，而在常规样本检测工作中，样本提取的病毒RNA浓度很难达到如此高，且RNA极易降解，如果能避免扩增后的开盖操作（电泳鉴定等），其假阳性率应与灵敏度相似的荧光RT-PCR方法相当，因此在LAMP方法的应用中，应严格避免开盖操作，同时进行实验室分区，这样可很大程度降低LAMP的假阳性率，增加其实用性。另外，LAMP最大的优势在于快速、灵敏且不需要复杂仪器，然而在临床诊断中，缺乏与之配套的、同样简单快速的样品前处理方案，这也是限制LAMP推广应用的另一个重要因素。虽然通过十几年的研究探索，国内外研究者提出了很多解决方案，也取得了一些进展，但其样本前处理技术距临床应用还有很大距离，需要进一步探索与创新。

4 结论

本研究建立的RRV RT-LAMP检测方法特异性良好，不与同属或相近病毒发生交叉反应；最低检测限可达10拷贝/反应，与荧光定量RT-PCR灵敏度相当；样品检测仅需1 h，相较于PCR法可节省1 h左右时间；操作简单，无需特殊仪器设备，简单的水浴锅即可满足要求；扩增结果判定方式多样化，可根据需求，借助实时浊度法、沉淀法或染料法进行。综合认为，本研究建立的RRV RT-LAMP检测方法可应用于我国虫媒病高发区的RRV筛查预警。