猪伪狂犬病毒gB抗原侧向层析快速检测试纸条的研制

王华俊，班付国，赵雪丽，谢彩华，闫若潜，王淑娟，马震原，王东方，王 翠

（河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008）

猪伪狂犬病（Porcine pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）引起的猪急性传染病，在猪群中常呈暴发性流行，是危害全球养猪业的重大传染病之一。近年来我国各地均有PR发生，尤其是2010年以来，由PRV基因变异强毒株为主要病原的仔猪流行性腹泻病严重危害了我国养猪业的健康发展，造成新生仔猪大量发病死亡，种猪严重繁殖障碍，育肥猪也有发病死亡[1-5]。该病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告动物疫病，是我国的二类动物疫病，也是《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》要求优先净化的疫病之一。

PRV 属于疱疹病毒科（Herpesviridae），其基因组为线性双链DNA，大小约150 kb，基因组编码16种囊膜蛋白。其中gB糖蛋白较为保守，能够诱导产生中和抗体，是免疫保护相关蛋白[6-7]。因此，检测PRV gB抗原是判定猪体内是否存在PRV的重要手段。

目前PRV的检测方法有数字微滴PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）、直接免疫荧光检测方法、液相芯片技术等[8-11]。但这些检测方法因需要特殊仪器设备，操作复杂，耗时耗力或不能快速检测病原等，无法应用于现场快速检测。侧向层析技术，

又称免疫色谱检测，已被广泛应用于激素、过敏原、药物、病毒、细菌等领域的检测分析[12-14]，具有操作简便、结果易于判断、成本低廉、敏感性好、特异性强等优点，是以上方法中最便捷的一种[15-16]。本研究采用侧向层析技术和单克隆抗体技术，建立一种简便、快速、敏感，适合现场快速检测和基层推广的PRV检测方法，将对该病净化和根除提供新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

抗PRV gB单克隆抗体杂交瘤细胞株10G4和6E9：河南省动物疫病预防控制中心制备并保存；弗氏不完全佐剂、氯金酸、柠檬酸三钠：Sigma公司产品；胎牛血清：荷兰Sra公司产品；DMEM高糖培养基：博士德公司产品；Millipore HF135：Millipore公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒：宝生物公司产品；牛血清白蛋白（BSA）：索莱宝公司产品；试纸条耗材：为上海金标生物公司产品。其他试剂均为国产分析纯化学试剂。

1.2 方法

1.2.1 抗PRV gB单克隆抗体10G4和6E9的制备 采用20%血清DMEM高糖培养基，分别复苏杂交瘤细胞株10G4和6E9，并调整细胞状态至生长对数期；将10G4和6E9细胞接种于经弗氏不完全佐剂处理过1周的Balb/C小鼠；7～10 d后，待小鼠腹部明显隆起，取小鼠腹水；4℃ 12 000 r/min离心10 min，去除上层油脂，取上清即为腹水；采用辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化腹水，并进一步采用Protein G亲和层析，用BCA蛋白浓度试剂盒测定浓度后分装冻存于−80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 胶体金制备 用量筒取200 mL 超纯水，倒入已硅化好的圆底烧瓶中，混匀；将圆底烧瓶放在磁力搅拌电热套的加热套内，放入磁力搅拌子，调节转速为180 r/min，加热至沸腾；继续加热5 min，先加入0.6 mL 10%（w/v）的氯金酸，然后加入0.96 mL 10%的（w/v）柠檬酸三钠溶液，继续加热10 min，直至溶液变为亮葡萄红色，停止加热；自然冷却至室温，用超纯水将金溶液体积定容至200 mL。加入不同剂量的柠檬酸三钠溶液（1.02、1.08 mL）制备不同粒径胶体金。采用紫外分光光度计进行全波长扫描鉴定，按照回归方程y=0.427x+514.56（y为最大吸收波长，x为胶体金粒径，单位为nm）计算粒径大小，并采用透射电镜鉴定。

1.2.3 最适标记pH和最佳抗体标记量优化 将所得的胶体金用0.1 mol/L 碳酸钾调节pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；取各 pH 的胶体金溶液500 μL于一系列胶体金润洗后的EP管中，在以上各pH条件下，用胶体金标记抗PRV gB单克隆抗体 10G4，蛋白标记量分别为4、6、8、10、12、14、16 μg，混匀后静置 30 min；加入10% BSA至终浓度为1%，混匀后静置10 min，9 000 r/min 离心10 min 后，重悬喷涂在胶体金结合垫上，组装成检测试纸条并检测灭活的1:200倍稀释PRV培养液，当试纸条性能最佳时，即为最适标记pH和最佳抗体标记量。

1.2.4 胶体金标记抗PRV gB单克隆抗体10G4 于硅化处理后的烧杯中，加入5 mL胶体金，用0.1 mol/L 碳酸钾调节至pH8.0，静置5 min；在磁力搅拌作用下缓慢滴加抗体，继续搅拌30 min，加入10% BSA至终浓度为1%；混匀后静置10 min，9 000 r/min 离心10 min，弃上清，加入金标抗体重悬液2.5 mL重悬。将制备的胶体金标记抗体，用三维喷金划膜仪喷涂在金标结合垫上，37 ℃真空干燥1 h，密封保存备用。

1.3 检测试纸条条件优化

1.3.1 胶体金标记抗体包被浓度确定 将制备的胶体金标记抗体，分别用重悬液做1、1.5、2、2.5和3倍稀释，喷涂于金标结合垫上，喷量为10 μL/cm，于37 ℃真空干燥箱中烘干1 h，然后裁切成宽5 mm 条状，并组装检测试纸条，进行阴性和阳性样本检测，依据试纸条背景色、检测线（T）和抗质控线（C）显色确定最佳稀释浓度。

1.3.2 检测线（T）和抗质控线（C）抗体包被浓度确定 将浓度为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL抗PRV gB单克隆抗体 6E9，分别与浓度为0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的兔抗小鼠IgG抗体组合，用三维喷金划膜仪，分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）位置，喷量为1 μL/cm，间距为5 mm，组装成检测试纸条，经阳性和阴性样品检测，观察C、T线显色情况，选择最佳浓度的C、T线抗体包被NC 膜。

1.3.3 试纸条装配 将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和硬质聚氯乙烯背衬，按顺序粘贴组装，用金标斩切仪切成5 mm 宽的长条，即为PRV gB抗原侧向层析快速检测试纸条。试纸条的装配见图1。

图1 试纸条模型

1.4 试纸条临床应用

1.4.1 待检样本处理 用拭子取猪鼻、眼腺、口腔分泌物，粪便或病变组织（研磨处理）样品，插入样品稀释液（体积比为0.05%的吐温-20 0.01 mol/L、pH7.4 的PBS）中洗涤，混匀，重复2～3次；

1.4.2 结果判定 取60～80 μL处理后样品直接滴加到样品垫上，10～15 min观察结果。C、T线均显色，表示阳性；只有C线显色，表示阴性；若只有T线显色或没有条带，结果无效，需重新检测。

1.4.3 试纸条敏感性试验 用样本稀释液，对TCID50为1×108.6/0.1 mL的PRV阳性样品进行1:80、1:160、1:320、1:640、1:1 280倍比稀释；取3个批次试纸条检测，每个批次3个，观察结果并确定试纸条的检测下限。

1.4.4 特异性试验 用3个批次试纸条，分别检测来源于临床疑似病例并经对应疫病国家标准检测方法鉴定为猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）的阳性样品，每个批次3个，观察结果。

1.4.5 试纸条稳定性试验 将试纸条干燥密封，分别保存于4 ℃、室温和37 ℃环境下，每间隔一定时间，取出检测标准阳性和阴性样品，观察其敏感性和特异性变化。

1.4.6 试纸条与RT-PCR检测结果比较 采集来自不同猪场的PR疑拟病例病变组织（脑、肺、肝、脾、淋巴结、流产胎儿等）及猪眼腺、鼻分泌物60份和国家级PR净化场猪眼腺、鼻分泌物45份、病料15份。剪取适量病料与600 μL样品稀释液混合，充分研磨，然后将猪眼腺、鼻分泌物加入200 μL样品稀释液，混匀；用试纸条和RT-PCR检测方法同时检测处理后的样品，评估两种检测方法符合率。

1.4.7 统计分析 对两种检测方法的比较统计分析，采用SPSS 22 Kappa一致性检验[17]。

2 结果与分析

2.1 10G4和6E9单克隆抗体浓度、效价和纯度

亲和层析纯化后，10G4和6E9单克隆抗体浓度分别为 3.87、4.55 mg/mL，间接ELISA法测得其效价均为 1:204 800，SDS-PAGE 电泳分析发现，经 Protein G层析柱纯化后的抗体纯度均大于90%，可用于胶体金标记。

2.2 胶体金颗粒鉴定

用紫外分光光度计，对制备的3种胶体金进行全波长扫描，发现最大吸收峰分别为528、522、518 nm，粒径大小分别约为31.5、17.5、10.0 nm，波峰较窄，颗粒分布均匀，大小一致（图2）；根据大分子蛋白标记条件，选择1号为标记胶体金。对1号进行透射电镜鉴定，发现粒径大小为31.7 nm，颗粒圆润，分散均一（图3），与紫外分光光度计鉴定结果基本一致。

图2 胶体金可见光光谱

图3 胶体金电镜图片（50 000×）

2.3 最适标记pH和最佳抗体标记量

胶体金标记后组装成检测试纸条并检测病毒培养液，当pH为8.0，抗体标记量为12 μg时，试纸条敏感性最高，即为最适标记pH和最佳抗体标记量。

2.4 最适稀释倍数、最适检测线和质控线抗体包被浓度

当对胶体金标记抗体做2倍稀释，T线抗体浓度为1.25 mg/mL， C线二抗为0.75 mg/mL时，试纸条C、T线显色最佳，敏感性高、特异性强、背景色浅，为最佳条件。

2.5 试纸条质量评估

2.5.1 试纸条敏感性 经测试，该检测试纸条最低能检测出1:640倍稀释的，TCID50为1×108.6/0.1 mL的灭活PRV抗原（图4）。

图4 试纸条敏感性检测

2.5.2 试纸条特异性 试纸条与CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV均无均交叉反应，阳性对照T线显色，特异性良好（图5）。

图5 试纸条特异性检测

2.5.3 试纸条稳定性 试纸条稳定性试验结果表明，试纸条在4 ℃条件下至少保存10个月，室温干燥密闭条件下至少保存10个月，37 ℃条件下可保存12 d，有很好的临床应用价值。

2.5.4 试纸条临床检测结果评估 试纸条与RTPCR方法的符合率评估结果显示，试纸条检测阳性42份、阴性78份，RT-PCR方法检测阳性48份、阴性72份，二者阳性和阴性符合数为104份，符合率为86.67%[(37+67)/120×100%=86.67%]。建立的试纸条检测评价四格表如表1。经SPSS 22统计软件分析，Kappa一致性检验，K=0.716，提示两种方法检测结果一致性较高，表明免疫胶体金检测试纸条检测结果正确率较高。

表1 引物序列

3 讨论

本研究利用实验室保存的抗PRV gB单克隆抗体杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，结合侧向层析技术，成功建立了一种快速、简便、敏感、易判定，适合基层大面积普查和现场检测应用的PRV gB 免疫胶体金检测试纸条。经检测试该试纸条最低能检测出1:640倍稀释的，TCID50为1×108.6/0.1 mL的灭活PRV抗原，与CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV均无均交叉反应，室温干燥密闭条件下至少保存10个月，具有良好的敏感性、特异性和稳定性。经Kappa一致性检验，发现K=0.716，提示两种方法检测结果一致性较高，表明免疫胶体金检测试纸条检测结果准确率较高，在临床上有良好的应用价值和商业发展前景。本试纸条的研制为PR净化和根除提供了新的检测手段。

选择粒径20～40 nm胶体金颗粒作为标记示踪剂，可使检测试纸条获得最佳性能[18]。本研究使用柠檬酸三钠作为原法剂，采用电炉加热制备胶体金并利用紫外分光光度计和透射电镜，对制备的胶体金进行质量鉴定，发现鉴定结果基本一致，粒径大小为31.5 nm，符合稳定、均一、圆润的胶体金制备标准[19]。

其他方法通常采用OD值曲线法来确定胶体金标记抗体最适标记pH和最小蛋白标记量，在此基础上多加20%蛋白。而本研究采用棋盘法，以试纸条敏感性和特异性为标准，确定最适标记pH和蛋白标记量，使结果更直观，能真实反映试纸条性能，同时提高了试纸条敏感性。

目前，PRV gE抗体检测广泛应用于PRV野毒感染分析，尚缺乏直接检测猪PR病原的血清学方法。猪感染PRV后7～14 d才产生血清抗体，因而通过抗体检测野毒感染相对滞后。检测PRV gB抗原是判定猪体内是否存在PRV的重要手段。本研究将该试纸条与分子病原学PCR 检测方法进行了比较，发现总符合率为86.67%。由于检测原理不同，二者符合率低于90%，表明试纸条敏感性有待进一步提高。今后将采用新的标记示踪剂、生物信号放大系统等方式优化其敏感性。

4 结论

本研究结合单克隆抗体技术和侧向层析技术制备了PRV gB抗原检测试纸条。经测试，该试纸条敏感性高，特异性强，稳定性好，是一种快速、简便、易判定，适合基层大面积推广应用的现场检测方法，商业应用前景良好，从而为PR净化根除提供了新的检测手段。