2013—2016年云南省江城县牛羊蓝舌病血清流行病学调查

寇美玲，苗海生，杨 恒，李 乐，李 楠，孟锦昕，廖德芳，李华春

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

蓝舌病是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的，通过库蠓等媒介昆虫传播的反刍动物虫媒病毒病。动物感染BTV的平均死亡率为30%，其中绵羊高达80%[1]。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，目前对其尚无有效的治疗方法[2]。近年来，随着全球气候变暖，库蠓活动范围不断向北和高海拔地区移动，不同血清型BTV流行范围不断扩大，部分地区出现了新血清型或强致病性BTV，对牛羊养殖业造成巨大威胁。目前我国已分离到1～5型、7型、12型、15～16型、21型和24型共11种血清型[3-7]。不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，因而给BTV防控带来了严峻挑战。

云南省江城县地处亚热带地区，相对湿度为85%，与老挝、越南两国接壤，适于库蠓的生长和繁殖，因而也易于BTV传播。本研究从2013年5月起，连续3年在江城县勐烈镇石头寨，设置BTV抗体阴性哨兵动物群，定期采血，进行BTV血清抗体监测和病毒分离，以了解近年来云南省反刍动物BTV流行情况，对蓝舌病预警、风险评估、流行病学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

BTV C-ELISA试剂盒、PBSTM（磷酸盐缓冲液+吐温20+脱脂奶粉）：云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；仓鼠肾细胞（BHK-21），白纹伊蚊卵细胞（C6/36），细胞用培养基MEM、M199，BTV 24个标准阳性血清：云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存；10日龄鸡胚：购自云南云岭广大公司；TRIzol总RNA提取试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）试剂盒：购自昆明上海丰科生物科技股份有限公司。

1.2 哨兵动物筛选及管理

2013—2015年期间，在每年的4月，采集1岁以下牛、羊血清各100份，用BTV C-ELISA试剂盒，检测备选动物血清抗体；选择10头BTV抗体阴性健康黄牛和5只阴性健康山羊为哨兵动物，设立哨兵动物监控群。3年累计设立监控群3个、哨兵动物45头（只）。耳标标识筛选出的哨兵动物，将其与其他牛羊混群放牧，其间禁止使用杀虫药。

1.3 样品采集

2013—2015年期间，在每年的5—10月，每周采血1次，11月至次年4月，每月采血1次。每次每头动物分别采集肝素抗凝血和常规全血各1份。常规全血分离获得血清，−20 ℃保存，用于血清学检测；肝素抗凝血4 ℃保存，用于病毒分离。

1.4 血清抗体检测

在高吸附ELISA 板上，包被1:1 000稀释的BTV 羊抗 50 μL/孔，4 ℃ 过夜，洗板后，加蓝舌病抗原50 μL/孔，37 ℃ 1 h洗板。在包被好的ELISA 板上，加入待检血清，阴性、弱阳性、阳性对照血清和PBS空白对照各2孔，每孔10 μL；所有孔均加入PBSTM（0.01 mol/L，pH7.2）稀释的兔抗BTV 血清（1:100稀释），50 μL/孔，震荡混匀后置37 ℃温箱里温育40 min，PBST洗液洗板2次，在吸水纸上轻轻拍干；加入1 000 倍稀释的绵羊抗兔酶标二抗，50 μL/孔，37 ℃温箱里温育40 min，用PBST洗液洗板6次，吸水纸上轻轻拍干；加TMB显色10 min后加终止液终止反应，读取OD450值，计算血清样品抑制率，以50%的抑制率作为临界值判定阴阳性[8-9]。

1.5 病毒分离

取100 μL肝素抗凝血样品于1.5 mL离心管中，加入1 mL无菌PBS（0.01 mol/L，pH7.2）混匀，1 500 r/min离心10 min，弃上清，洗涤重复3次；弃上清加入900 µL无菌双蒸水，涡旋混匀，0.1 mL/枚静脉接种鸡胚，每份样品接3枚；逐日观察，将1 d后死亡胚4 ℃保存，连续观察5 d后，取出胚体，收获鸡胚肝脏；将收获的肝脏用组织捣碎机捣碎，PBS悬浮，3 000 r/min，离心10 min，取上清液200 μL接种于长成70%～80%单层C6/36细胞瓶（25 cm2）中，28 ℃培养箱中培养7 d后，将细胞瓶冻融3次，取500 μL接种于长成70%～80%单层BHK-21细胞，将出现病变的放于−80 ℃保存，未出现病变的冻融3次后，继续在BHK-21细胞上传两代，仍未出现细胞病变的舍弃。

1.6 细胞病变样品BTV鉴定

根据本实验室现有BTV基因序列，针对较为保守的S7（表达VP7蛋白）片断设计引物。上游引物为5'-GTTACAATGCGCCCGACATC-3'，下游引物为5'-TGTAATGCGGCCTGTCCAT-3'，扩增产物长度为1 156 bp，由大连宝生物工程有限公司合成，用RNase-free ddH2O稀释成20 pmol/μL备用。参照TRIzol总RNA提取试剂盒说明书进行病毒RNA提取，将样品总RNA 95 ℃加热5 min，使双链RNA解链。用PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2（Dye Plus）进行RT-PCR。反应体系为 25 μL：2×1 step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，VP7 基因引物各 0.5 μL，RNase free ddH2O 5.5 μL，RNA 解链后样品 5 μL。反应条件：42 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个偱环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。用1.2 %琼脂溶液配制凝胶，进行电泳检测。

1.7 BTV毒株血清型鉴定

按Karber方法计算TCID50/50 μL，应用南非参考毒株标准血清，参照国标《蓝舌病诊断技术》（GB/T18636—2017）[9]方法进行。

2 结果

2.1 哨兵动物BTV抗体检测

2013年5月—2016年4月，共采血73次，收集牛羊血清样品1 095份。应用BTV C-ELISA方法进行检测。检测结果显示（表1），2013—2014年哨兵动物群BTV平均抗体阳性率为40.35%，2014—2015年为44.08%，2015—2016年为50.65%。

表1 2013—2016年哨兵动物BTV抗体检测情况统计

检测结果显示，2013—2014年度，从5月底开始，部分哨兵动物BTV抗体转阳，截至10月底共有9头（只）哨兵动物转阳（图1、图2）；2014—2015年度，从5月底开始，部分哨兵动物BTV抗体转阳，截至10月底同样有9头（只）哨兵动物转阳（图3、图4）；2015年—2016年度，从5月底开始，部分哨兵动物BTV抗体转阳，截至10月底共有13头（只）哨兵动物转阳（图5、图6）。

图1 2013年5月—2014年4月哨兵动物（山羊）抗体消长曲线

图2 2013年5月—2014年4月哨兵动物（黄牛）抗体消长曲线

图3 2014年5月—2015年4月哨兵动物（山羊）抗体消长曲线

2.2 病毒分离

BTV毒株在BHK-21细胞上产生明显的细胞病变，细胞病变产生比较迅速，接种BHK-21细胞1 d后，就可观察到明显细胞病变，接种培养4 d后 ，镜下可见细胞发生融合、空泡化及呈现网状或放射状等典型的细胞病变（图7）。

图4 2014年5月—2015年4月哨兵动物（黄牛）抗体消长曲线

图5 2015年5月—2016年4月哨兵动物（山羊）抗体消长曲线

图6 2015年5月—2016年4月哨兵动物（黄牛）抗体消长曲线

图7 接种分离株后4 d 的BHK-21细胞病变（50×）

2013年5月—2016年4月，在哨兵动物中共分离到9种血清型的BTV毒株，分别为1～5型、15～16型、21型、24型（图8、表3）。其中2013年5月—2014年4月，在3只山羊血液内分离到BTV毒株，血清型为1、2、3型，在7头黄牛血液内分离到BTV毒株，血清型为1、2、4、16型；2014年5月—2015年4月，在3只山羊血液内分离到BTV毒株，血清型均为4型，在8头黄牛血液内分离到BTV毒株，血清型为3、4、15、16、21型；2015年5月—2016年4月，在2只山羊血液内分离到BTV毒株，均为4型，在8头黄牛血液内分离到BTV毒株，血清型为4、5、16、24型。连续3年的病毒分离结果表明，山羊主要感染1～4型，黄牛可感染已发现的所有血清型毒株。

图8 2013年5月—2016年4月江城县分离BTV血清型情况

表3 2013—2016年哨兵动物BTV分离鉴定结果统计

3 分析与讨论

我国对蓝舌病等动物虫媒病的研究相对滞后，对BTV分布、流行情况缺乏系统研究，这给蓝舌病防控带来较大困难。本研究于2013年5月—2016年4月，连续3年在云南省江城县勐烈镇石头寨设立牛、羊监控群，进行BTV血清学调查和病毒分离。为保证研究结果的真实性，在每年4月份筛选BTV阴性哨兵动物进行持续监测，因而检出的血清阳性率可以反映当年牛、羊自然感染情况。调查结果显示，2013年哨兵动物群BTV抗体阳性率为40.35%，2014年为44.08%，2015年为50.65%，阳性率逐年增加，说明BTV在江城县长期存在并有逐渐活跃的趋势。

蓝舌病是由库蠓传播的一种虫媒病毒病，因此其流行规律主要取决于库蠓的活动情况。本研究监测点位于云南省江城县，地处亚热带地区，年平均气温18.7 ℃，年均降雨178 d，年均日照1 886 h，相对湿度85%，适于库蠓的生长和繁殖，因而也易于BTV传播。连续3年的监测发现，哨兵动物BTV抗体转阳时间均在5—10月，提示蓝舌病防控的关键时期是每年的5—10月份。

3年内，在江城县共分离到9种血清型BTV毒株，其中2013年分离到5种，分别为1、2、3、4、16型；2014年分离到5种，分别为3、4、15、16、21型；2015年分离到4种，分别为4、5、16、24型。这说明江城县存在多种血清型BTV的流行，且4、16型为优势血清型。3年间，分离到BTV的新血清型种类逐年增加，2014、2015年各发现2种新血清型，表明江城县BTV有多种血清型存在，流行态势比较复杂，防控形式严峻。因此，亟需加强对该地区BTV流行状况和流行规律的监测，同时加紧主要流行毒株诊断技术和疫苗的研究，提高蓝舌病预警和防控能力，及时发现变异强毒株并妥善处理感染动物。

4 结论

本研究从2013年5月至2016年4月连续3年，在江城县设立哨兵动物群进行BTV抗体监测和病毒分离。研究结果表明，BTV在江城县长期存在且有流行程度加重趋势，多种血清型毒株交叉感染状况较为普遍且更加复杂，因此亟需加大BTV监测力度。