天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

霍奕安，刘荣荣，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋，陈成勋

（1. 天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津农学院创新创业实验室，天津 300384）

锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）又称为鲤科疱疹病毒3型（CyHV-3），是引起高度传染性锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的病原[1-3]。1998年KHV首次在以色列和美国引发疫情，2002年在我国广东省被发现，随后陆续到传播到我国其他地区。至今已有30多个国家或地区陆续报道发生该病[4]。KHVD潜伏期长，突发性高，给鲤鱼养殖业造成了严重危害。目前来自不同国家的4个KHV DNA全基因序列已被测序[5]。病毒检测和减毒疫苗免疫是KHVD最主要的控制措施[6]。

锦鲤是我国观赏鱼的主要养殖品种之一，在国内淡水养殖鱼类中占很大比例，一旦暴发KHVD，往往带来巨大经济损失，所以开展KHV相关研究十分重要。2017年6月，天津市滨海新区、北辰区等一些养殖场的锦鲤陆续大量发病死亡，3 d内死亡率高达85%。病鱼表现烂鳃、鳃丝发白、鳞片脱落等症状，以及内脏器官出血、糜烂等剖检病变，疑似感染KHV。本研究根据KHV基因序列分别设计合成TK、SphI-5、ORF25、ORF56和ORF81基因特异性引物，采用PCR技术检测KHV相关功能基因，为KHVD诊断及流行病学分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼、试剂及仪器

试验鱼：天津市滨海新区、北辰区等一些养殖场送检的发病锦鲤，平均体长为（6±0.5）cm；试剂及仪器：DL 2 000 bp DNA Marker（天津生工生物公司），DNA提取试剂盒、PCR Master Mix（天根生化科技有限公司），Buffer蓝DNA染料（北京鼎国昌盛生物技术公司），PCR扩增仪（德国Analytikjena公司）。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank数据库登录的KHV TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因序列（AP008984.1），利用Primer Premiers 5.0软件设计特异性引物（表1）。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 基因PCR扩增

表1 锦鲤疱疹病毒 TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因引物设计

分别取患病锦鲤的鳃、肾脏、脾脏、肝脏、胰脏等组织匀浆，使用DNA提取试剂盒提取DNA，将所得DNA样品通过琼脂糖凝胶电泳检测。PCR方法采用25 μL反应体系： Mix 10 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），加双蒸水至25 μL。反应条件如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 40 s，59.3 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环。其中，阴性对照加双蒸水，引物加TK基因。

1.4 序列比对与系统发育树构建

选取锦鲤疱疹病毒3型J2株（CyHV-3/KHV-J2）、锦鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）的ORF56蛋白为参考序列，应用GeneDoc软件进行序列比对分析。从GenBank下载KHV的ORF56基因序列，通过MEGA5.0进行系统发育进化树构建，并分析进化亲缘关系。

2 结果

2.1 发病锦鲤临床症状及初诊

发病锦鲤大量死亡，死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、鳃丝发白、鳞片脱落、体表黏液增多等症状，以及鳃坏死、内脏器官出血糜烂等剖检病变（图1）。

图1 锦鲤疱疹病毒病的临床特征

2.2 基因检测与序列比对

以锦鲤鳃和肝胰脏等组织器官的DNA为模板，分别对KHV TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因进行PCR检测，发现均为阳性（图2）；DNA测序获得 TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段分别为 409、300、317、939、156 bp。经BlastN检索，发现与印度尼西亚毒株CyHV-3-J2的TK基因序列同源性为99.2%（AOO32620.1）、SphI-5为97.6%（AOO32619.1）、ORF25为97.8%（AP008984.1）、ORF56为 100%（KX544843.1）、ORF81为98.0%（AVL27853.1）。进一步选取锦鲤疱疹病毒3型J2株（CyHV-3/KHV-J2）、锦鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）等进行序列比对，发现ORF56蛋白与KHV蛋白的151～253 aa为高保守区域（图3）。

2.3 ORF56基因系统发育树分析

选取11个KHV ORF56相关基因进行系统发育树构建分析，发现KHV天津流行株与CyHV-3型病毒亲缘关系最近，并且与印度尼西亚CyHV-3-J2毒株自然聚为一支，最终确定天津市患病锦鲤感染的病毒为CyHV-3型（图4）。

图2 KHV基因PCR检测电泳图

图3 ORF56相关蛋白的氨基酸序列比对分析

图4 基于KHV病毒ORF56基因序列的系统发育树分析

3 讨论

KHVD作为一种全国流行性鱼类病毒病，其流行株主要为CyHV-3型病毒，已引起我国高度重视。近年来，虽然世界多地在KHVD临床症状、检测诊断、疫苗制备等方面进行了大量研究，但仍不足以有效控制该病，其依旧在威胁着我国锦鲤养殖业。

PCR检测技术具有简便、快速，对标本纯度要求低以及灵敏度高等特点，在水产病毒病诊断领域被广泛应用[9-11]。自从Gilad等[12]应用PCR技术建立了CyHV-3检测方法后，PCR及其延伸技术成为水生动物疾病检测的常用方法。本试验针对KHV的TK、SphI-5基因，以及ORF25、ORF56、ORF81等未知功能基因，建立特异性PCR方法进行检测，最终确诊为锦鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）。分析显示，其与已报道的印度尼西亚病毒株CyHV-3-J2亲缘关系最近[13-15]。此外，建立的CyHV-3型病毒ORF25、ORF56、ORF81等未知功能基因PCR检测方法，不仅有助于了解KHV的基因功能及致病机制，而且为KHV的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。