口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

谢彩华，班付国，闫若潜，王东方，张 煜，刘梅芬，赵雪丽，马震原，王华俊，王淑娟

（1. 河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008；2. 开封市动物卫生监督所，河南开封 475000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-andmouth disease virus，FMDV）引起的猪、牛、羊等家养及野生偶蹄动物共患的一种急性、恶性、高度接触性传染病，70多种动物对其易感[1-3]。该病传播途径多、速度快，曾在世界范围内多次暴发流行，造成巨大政治影响和经济损失[4-5]，为此世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物传染病。FMD也是危害我国养猪业最为严重的动物疫病之一，为此我国将其列为一类动物疫病，被纳入国家强制免疫计划病种。FMDV为小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，最大颗粒直径为23 nm，最小为7～8 nm。目前已知FMDV在全世界有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ型7种血清型，且各血清型之间的交叉保护力很差[6]。在我国和邻国流行的主要有O、A、AsiaⅠ三种血清型[7]。由于FMDV血清型较多，因此利用简单、快速、准确的检测方法，尽早作出型的鉴别诊断，对控制FMD至关重要。目前，世界口蹄疫参考实验室检测FMDV及定型的常规方法仍是ELISA、病毒分离、RT-PCR等[8-9]。实时荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）是一种新型诊断工具，具有敏感、快速、准确的特点，并能在快速扩增核酸同时，实现模板的定量测定[10-11]。目前发展起来的多联实时荧光PCR技术可以在同一个PCR反应中，通过Tm值分析来区分不同的核酸片段，这为同时检测多种病原提供了技术基础。本研究根据O、A、AsiaⅠ三种血清型 的FMDV保守基因序列，设计了能够检测到FMDV多种血清型的特异性通用型和A型检测引物，以及不同荧光素标记的MGB探针，建立了FMDV通用型、A型二重荧光定量RT-PCR检测方法，为FMD的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与样品 O、A和AsiaⅠ型FMDV标准株：中国农业科学院兰州兽医研究所试剂盒中的阳性对照；灭活的猪水泡病病毒（SVDV ）、猪水泡性口炎病毒（VSV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）和猪肺炎支原体等：河南省动物疫病预防控制中心实验室提供；临床样品：河南省动物疫病预防控制中心实验室提供；SVDV、VSV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV、PPV阳性样品：河南省动物疫病预防控制中心保存。

1.1.2 仪器设备与主要试剂 KingFisher全自动核酸提取仪：购自美国Thermo Fisher公司；DNA/RNA磁珠提取试剂盒：购自Abmion公司；ABI 7500荧光定量PCR仪：购自美国ABI公司；Ex Taq DNA聚 合 酶、Rnase Inhibitor、DL 2 000 bp DNA Marker、DNA回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒：购自宝生物工程（大连）有限公司；M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体：购自Promega公司；口蹄疫荧光定量RT-PCR检测试剂盒：购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 经大量比对GenBank中FMDV 3种血清型的保守基因序列和FMDV-A型VP1基因序列，选取FMDV O、A、AsiaⅠ三种血清型的3C基因和FMDV-A型VP1基因高度保守且具有型特异性的序列为模板，设计通用型（FMDV-T）和A型（FMDV-A）特异性引物对和TaqMan MGB探针。序列为：P1：5'-cggcctctcatccaacaga-3'；P2：5'-attttccttcaggcgcttga-3'；P3：5'-aaccccaccgcctacca-3'；P4：5'-ggtgtaagggagcgcaagtc-3'；Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg-MGB-3'；Probe-P6：5'-VIC-aagcagccgtttacg-MGB-3'。引物及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2 模板制备 利用King fisher全自动核酸提取仪，参照磁珠法核酸提取试剂盒说明书提取O/A/AsiaⅠ FMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PEDV 总RNA和PCV2、PRV、PPV总DNA。将RNA反转录成cDNA，将cDNA和总DNA用于PCR扩增或于−20 ℃冻存备用。

1.2.3 FMDV-T/FMDV-A标准品制备 将FMDV-T/FMDV-A阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒，送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序。将测序正确的FMDV-T/FMDV-A重组阳性质粒，应用分光光度计测定其OD260和OD280并计算OD260/OD280值，共重复5次；参考Kim等[12]介绍的方法计算浓度，计算得出的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A质粒DNA浓度分别为9.12×1010和9.11×1010拷贝 /μL，然后定量并稀释至 1.0×100～1.0×1010拷贝 /μL，−20 ℃保存备用。

1.2.4 二重FQ-PCR反应条件优化 将pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒分别稀释至终浓度1.0×105拷贝/μL，并以此作为检测模板。P1/P2、P3/P4引物和Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和 1.0 µmol/L。应用荧光 PCR仪，采用矩阵法筛选不同浓度的FMDV-T/FMDV-A引物和探针组合，对PCR 反应温度、反应时间、PCR 的各循环数进行优化，以获得最低Ct 值和较高的荧光强度。

1.2.5 二重FQ-PCR特异性试验 取O/A/AsiaⅠFMDV，以及猪水疱病等其他7种疫病病毒进行核酸提取，同时设pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒混合物为阳性对照，细胞培养液为阴性对照，按已优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增，以验证该方法的特异性。

1.2.6 二重FQ-PCR敏感性试验 将pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒分别作10倍系列稀释，将两种质粒按1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为 1.0×104～1.0×100拷贝 /μL，共5个稀释度，按已优化的FQ-PCR反应条件进行FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR敏感性试验。

1.2.7 二重FQ-PCR稳定性和重复性试验 分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组等量质粒混合物（每种质粒终浓度 1.0×103～1.0×100拷贝 /μL），按照已优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。

1.2.8 二重FQ-PCR临床试验 依据建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR和本实验室建立的FMDV-T/FMDV-A RT-PCR检测方法以及中国农业科学院兰州兽医研究所荧光定量RT-PCR试剂盒说明书，配制检测试剂，以FMDV-T/FMDV-A阳性质粒混合物为阳性对照，细胞培养液为阴性对照，对123份临床疑似FMDV感染样品（样品编号1～123）进行应用检测，对这3种方法的检测结果进行比较分析，并与FMDV测序结果比较。

2 结果与分析

2.1 二重FQ-PCR反应条件优化

结果表明，通用型和 A 型各引物和探针采用以下浓度扩增效果最好：反转录引物37 ℃反转录1 h；P1、P3、P5、P6 浓度均为 200 nmol/L，P2、P4浓度均为400 nmol/L。优化后的反应程序为：94 ℃ 6 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，重复 40 个循环。阴性对照的检测结果应无特定扩增曲线，且Ct＞30.0或无，阳性对照Ct≤27.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct≤30.0，且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct＞30.0或无，且无特定的扩增曲线，则判定为阴性；30.0≥Ct＞27.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，需重复验证。FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR的扩增曲线见图1。

图1 FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR的扩增曲线

2.2 二重FQ-PCR特异性试验

用所建立的二重荧光 RT-PCR，对FMDV O、A、AsiaⅠ型进行检测，发现通用型FAM通道阳性，A型VIC通道阳性，对其他7株常见动物 RNA/DNA病毒检测均呈阴性反应。试验数据表明，所设计的引物探针只对目的病毒特异，与其他检测对象无交叉反应（图2）。

图2 FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法的特异性试验

2.3 二重FQ-PCR敏感性试验

按已优化的FQ-PCR反应条件进行检测，发现pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A终浓度为 1.0×104～1.0×100拷贝 /μL，共 5 个稀释度的质粒；FMDV-T和FMDV-A最低检出限均为1.0×101拷贝 /μL（表 1） 。

2.4 二重FQ-PCR稳定性和重复性试验

表1 二重FQ-PCR敏感性试验结果

试验结果显示，浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103拷贝/µL 3个浓度的FMDV-T/FMDV-A重组质粒等量混合物3次试验结果均为阳性，浓度为1.0×102拷贝/µL的FMDV-T/ FMDV-A重组质粒等量混合物3次试验结果均为阴性，说明建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性（表2）。

表2 二重FQ-PCR方法的重复性试验结果

2.5 二重FQ-PCR临床试验

结果显示：采用本研究建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR检测，10份为FMDV-T阳性，6份为FMDV-T/FMDV-A双阳性，其余为阴性；采用RT-PCR检测，9份为FMDV-T阳性，6份为FMDV-T/FMDV-A双阳性；兰州兽医研究所的荧光定量RT-PCR试剂盒检测，10份为FMDV-T阳性，6份为FMDV-T/FMDV-A双阳性。结果表明，本研究建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法比RT-PCR方法灵敏性高。该FQ-PCR方法检测结果与和FMDV基因测序结果及兰州兽医研究所的荧光定量试剂盒检测结果符合率为100%，表明建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法具有很好的临床应用效果。

3 讨论

本研究主要在同一反应管内进行FMDV 通用型和A型的二重扩增检测反应，同时收集代表FMDV通用型和A型的荧光信号，对扩增产物进行实时在线检测，从而建立了能够同时检测FMDV通用型及A型二重鉴别实时荧光RT-PCR方法。实验室试验和田间试验均证实，该方法是一种快速、简便、高效的检测平台。目前，我国主要流行O型和A型FMD，而AsiaⅠ型自2009年之后未见临床病例报道[4]，并且国家已退出AsiaⅠ型FMD的强制免疫，因此主要针对FMDV的O型和A型进行病原鉴别诊断。本研究建立的二重FMDV通用型和A型检测方法为国内流行FMDV血清型的鉴别诊断提供了方便、快速、特异、灵敏的检测方法。

多重实时荧光 RT-PCR 可同时进行FMDV不同亚型的鉴别检测[12]，因而大大缩短了检测周期。在临床混合感染前期，病毒主要以潜伏感染形式存在，病毒量很低。而本研究建立的二重FQ-PCR检测FMDV-T和FMDV-A的最低检出限为1.0×101拷贝/μL，因此也能准确检测区分出来。

口蹄疫是猪、牛、羊等家养及野生偶蹄动物共患的传染病，与多种病毒病的临床症状类似，但本研究因受病原毒株限制，仅与SVDV、VSV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV、PPV等7种病原进行了特异性试验，未与猪塞内卡病、水泡性口炎、猪水泡疹、羊口疮、羊痘等与口蹄疫症状类似的疫病病原同时进行检测验证，因此仍需进一步研究完善。

4 结论

本研究成功建立了FMDV通用型和A型二重鉴别实时荧光 RT-PCR 检测方法。检测表明，该方法重复性好、敏感性高、特异性强，最低检测模板浓度为10 拷贝/μL，可用于FMDV的快速检测及分型鉴定。本研究为FMDV的早期快速检测、型鉴别诊断提供了特异、敏感、快速的新方法，具有一定的临床应用价值。