山东省部分地区毛皮动物犬瘟热病毒与细菌混合感染的检测

李 超，陈金凤，宋彩玲，庞巍建，张博文，刘 刚

（1. 青岛海华生物医药技术有限公司，山东青岛 266555；2. 青岛海润检测股份有限公司，山东青岛 266555）

毛皮动物养殖业现已成为山东省农业经济发 展的新增长点。近年来，毛皮动物养殖量和养殖密度不断增加，毛皮动物及毛皮交易日益频繁，疫病发生和流行亦变得日趋复杂[1]。犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）是引起犬科、鼬科及一部分浣熊科或其他食肉目动物犬瘟热（Canine distemper，CD）的病原[2]，属副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus），为单股、不分节段、负链RNA病毒。

目前CDV在世界范围内广泛流行，感染宿主范围不断扩大，多种动物都可感染[3]。CDV只有1个血清型。CDV血凝素蛋白（H）是CDV的主要结构蛋白之一，能够产生中和抗体，在犬瘟热免疫预防方面起着重要作用。在麻疹病毒属所有结构蛋白中，H 蛋白基因变异最大，抗原变化最高。根据CDV H基因序列构建的系统进化树分支上，同源性高于95%的毒株可归为同一基因型的原则[4]，目前CDV主要分为Asia-1、Asia-2、America-1（Vaccines）、America-2、Europe、European wildlife、Arctic 7 个基因型[5]。本研究根据山东省威海、青岛等市水貂养殖场病死貂的发病情况、临床症状、剖检变化、CDV检测，结合细菌分离鉴定和动物试验，统计分析CDV与细菌混合感染的比例，并对RT-PCR检测阳性病料进行CDV H蛋白基因测定，研究分析CDV H基因的分子进化和变异情况，为规模化养殖场疫病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料样品 采集2017年山东省威海、青岛、临沂等市16个毛皮动物养殖场送检的病死水貂、狐狸、貉子等的脑、肺、肝、脾等脏器。每个养殖场送检1只，共计16只。

1.1.2 细菌学试验所用试剂材料 营养琼脂（NA）、西蒙式枸橼酸盐琼脂（SCA）、麦康凯培养基（MAC）、伊红美蓝培养基（EMB）、SS 琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基等：购自青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌单因子血清：购于中国兽药监察所；血琼脂平板：自行配置；微量生化鉴定管：购自杭州天和微生物试剂有限公司；BALB/c小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、蒸馏水、无菌水、结晶紫、番红、碘液、香柏油等试剂材料：均由青岛海华生物医药技术有限公司提供。

1.1.3 病毒学试验所用试剂材料 反转录酶Superscript III Reverse Transcriptase：购自Invitrogen公司；RNA酶抑制剂、LA-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2 000 bp DNA Marker、pMD19-T载体试剂盒：购自大连宝生物工程有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA提取试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司公司；X-gal、IPTG：购自Promega公司；DEPC：购自Sigma公司；氨苄青霉素钠盐（Amp）、焦磷酸二乙酯（DEPC）、琼脂糖凝胶回收试剂盒：OMEGA公司产品；无水乙醇、EDTA、氯仿、琼脂糖、溴酚兰：购自天津化学试剂三厂；异丙醇：购自上海埃彼化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病料处理 用无菌剪刀剪取病死动物的脑、肺、肝、脾等脏器组织，各分为2份：一份加少量灭菌PBS（含青霉素、链霉素各1 000 U/mL），放入灭菌研钵内研磨成匀浆，反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，取上清用0.22 μm的无菌滤器除菌，分装入无菌EP管内，−80 ℃保存备用；另外一份用于细菌分离。

1.2.2 细菌分离 用接种环无菌取病料，采用平板划线法接种于营养琼脂、麦康凯琼脂、绵羊血琼脂培养基，分别在37 ℃需氧和厌氧条件下培养1 d，再挑取单菌落在适宜培养基上划线分离培养，如此反复，直到培养基上的菌落特征相同时，再挑取单个菌落，涂片、染色、镜检，观察菌体大小和染色特征；将分离菌株分别接种麦康凯琼脂平板、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板和SS琼脂平板，分别在需氧和厌氧条件下，37 ℃培养2 d后，观察菌落形态及生长情况。

1.2.3 分离细菌的鉴定 先进行革兰氏染色和形态学鉴定，然后将分离菌株分别接种于含有枸橼酸盐、尿素酶、木糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、ONPG、甘露醇、肌醇等微量生化试管，37 ℃培养1～7 d，观察和记录试验结果并进行生化特性鉴定；将分离纯化的细菌接种于TSB肉汤培养基中培养1 d，然后提取分离菌株的基因组DNA。采用引物16S-F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTC-3'，16S-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3'扩增细菌16SrRNA；将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，并送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序，对获得的基因序列通过NCBI的BLAST检索系统进行基因序列同源性比对，进行细菌种属鉴定和分子生物学鉴定；将鉴定好的菌株全部放入37 ℃ LB肉汤或营养琼脂培养基中培养，−80 ℃下保存于含25%甘油的无菌生理盐水中。

1.2.4 病毒RNA提取 按EasyPure Viral DNA/RNA提取试剂盒说明书提取。

1.2.5 样品RT-PCR检测 按照文献[6]，合成1对CDV诊断引物P1/P2，可扩增CDV NP基因的242 bp目的条带，退火温度为55 ℃。所用引物序列见表1。

表1 本试验应用的引物序列

1.2.6 H基因克隆和测序 按照Bi等[7]所设计的引物，合成1对CDV H基因测序引物CDV-P3/P4，可扩增CDV H基因1 824 bp的目的条带；采用宝生物胶回收试剂盒，对经电泳检测与预期大小片段相符的条带进行回收后，连接pMD19-T载体，转化感受态细胞，经涂板、摇菌后进行阳性克隆鉴定；将鉴定为阳性的菌液，送北京六合华大基因公司测序。

1.2.7 H基因序列分析 从GenBank中下载已知的CDV H基因序列（参考毒株详细信息见表2），用MegAlign软件与测得的基因序列进行核苷酸序列比较，分析序列间的同源性及氨基酸序列差异。将全部序列导入MEGA 5.1软件，采用最大拟然法，绘制系统发育进化树。

1.2.8 大肠杆菌O抗原制备及血清型鉴定 将已纯化培养的大肠杆菌菌株划线接种于营养琼脂斜面上，37 ℃培养1 d；用5 g/L石炭酸生理盐水2 mL洗脱菌苔，制成浓稠菌悬液，121 ℃高压2 h，破坏其K、H抗原，得到O抗原；通过玻板凝集试验，用标准O型分型血清，对分离菌株进行血清型鉴定，同时以检测抗原与石碳酸生理盐水混合物作为对照，观察有无自凝现象，若1 min内出现明显凝集，则判为阳性。

1.2.9 分离菌的BALB/c小鼠致病力试验 将分离纯化的细菌，采用平板计数法确定注射菌液的活菌浓度约为1×109个/mL。将0.2 mL该菌TSB纯培养液腹腔接种体重约20 g的BALB/c小鼠10只，另设5只小鼠作为正常对照，仅腹腔接种0.2 mL无菌生理盐水，观察1 d内小鼠发病和死亡情况。

2 结果

2.1 病理变化

剖检结果显示，病死毛皮动物表现不同程度的脑膜充血、间质性肺炎、出血性肺炎、肝脏黄疸及肾脏肿大等显著的病理变化（图1）。

图1 毛皮动物临床解剖病理变化观察结果

2.2 细菌感染情况

细菌分离培养结果显示：16只病死毛皮动物的肝脏和肺脏中均分离出细菌，细菌分离率达100%，其中绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血葡萄球菌、β溶血性链球菌的分离率分别为35%、30%、5%、5%、5%、5%、5%、5%。细菌致病性试验显示，不同绿脓杆菌分离株对小白鼠均有高致病力，不同血清型大肠杆菌的致病力存在差异，溶血葡萄球菌、β溶血性链球菌分离株对小白鼠无致病。具体细菌分离情况和致病性试验结果见表2。

表2 2017年山东省部分地区毛皮动物细菌分离情况与致病性试验结果

2.3 病料RT-PCR检测

以CDV P1/P2为引物，以试剂盒提取的病毒RNA为模版，经RT-PCR检测，电泳得到约242 bp的条带，与预期结果相符（图2）。经检测，16份病料中，共检测出11份CDV阳性，检出率为68.8%。

图2 病料的CDV RT-PCR检测结果

2.4 阳性病料的CDV H全基因扩增

采用引物CDV-P3/P4，将11份阳性病料进行CDV H基因RT-PCR扩增，电泳得到约1 824 bp的条带，与预期结果相符（图3）。

图3 阳性病料CDV H 基因RT-PCR扩增结果

2.5 CDV H基因遗传进化分析

将测得的11个CDV H基因序列和26株国内外CDV参考毒株H基因核苷酸序列，应用MEGA5软件构建系统进化树并进行分析。结果显示（图4）：所有毒株被分成7个基因型；本研究分离到的9株CDV毒株属于Asia-1型，与我国绝大部分毒株基因型相同，均处在一个分支，属野毒株，2株属于America-1（Vaccines）型，与疫苗株处在一个分支，可能是疫苗毒。

2.6 CDV H基因同源性分析

图4 CDV野毒株与参比毒株H基因序列系统发育进化树

图5 山东省部分地区CDV与疫苗株H基因同源性分析

测序结果显示，11株CDV毒株的H基因编码区全基因序列全长1 824 bp，共编码607个氨基酸。使用MegAlign对CDV H基因测序结果与疫苗毒株序列进行多重序列比对分析，发现山东省这些地区的CDV野毒株的核苷酸同源性为99.0%～100%，与疫 苗 株 CDV11、CDV3、Onderstepoort、Convac、Snyder Hill、Lederle的核苷酸同源性为90.1%～91.1%（图5）。

3 讨论

动物机体抵抗力下降和饲养管理水平低下时，都可能引起大肠杆菌等条件性致病菌感染，因此应加强饲养管理，创造良好的养殖环境，以减少细菌病，尤其是条件性致病菌病的发生。毛皮动物养殖业正朝着集约化方向发展，养殖密度不断增大，细菌病在临床上危害需引起足够重视。毛皮动物饲养场需要做好CDV弱毒疫苗免疫工作，加强日常消毒，保证养殖场的饲养环境卫生。

犬瘟热发病率高，治愈率低，给我国毛皮动物养殖业带来很大危害，导致经济损失惨重。近年来，世界多个国家和地区都有免疫动物暴发犬瘟热疫情的报道。在免疫压力下，H 蛋白抗原容易发生漂变，这可能是导致目前犬瘟热免疫失败的重要原因[8-9]。本试验采集山东部分地区病料，利用RT-PCR方法对CDV H 基因进行扩增并测序，并将H 基因序列与GeneBank上以发表的对应H 基因作序列比较分析，发现H 基因编码区的核苷酸同源性在99.0%～100%之间，与传统疫苗株的同源性在90.1%～91.1%之间。基于H 基因构建的系统进化发生树显示，分离出的11株CDV毒株中，有9株属于野毒株谱系，与国内绝大部分分离株同属于Asia-1型，2株属于疫苗株谱系，属于America-1（Vaccine）基因型。这与王贵升等[1]、王聪等[10]分子流行病学调查研究结果一致，说明其他亚型的CDV毒株暂未在山东部分地区流行。本研究通过对H 基因进行遗传进化分析，阐述山东部分地区CDV的群属，对犬瘟热的免疫指导，研发适合当前流行毒株的CDV疫苗十分必要。

革兰氏阴性菌特别是一些毒力较弱的机会致病菌，已经严重地威胁着养殖业发展，并给养殖业带来了严重的经济损失[10-11]。本研究分离的绿脓杆菌分离株对小白鼠具有强致病性，是造成毛皮动物出血性肺炎的主要病原。

本研究结果表明，绿脓杆菌和致病性大肠杆菌是威胁毛皮动物的主要致病菌。针对毛皮动物细菌及CDV混合感染情况的检测，可以推断犬瘟热免疫失败继而造成CDV与细菌混合感染，可能是导致毛皮动物大规模死亡的一个重要原因，这为规模化毛皮动物养殖场有效地控制疫病提供了一定的理论依据。

4 结论

本研究采集山东威海、青岛、临沂等市水貂养殖场16只病死貂病料，进行CDV检测和细菌的分离培养，发现 CDV和细菌混合感染较为普遍，检出率为68.75%；混合感染的细菌种类复杂，共分离到绿脓杆菌、大肠杆菌等8种菌株。CDV分离毒株大部分属于野毒株谱系，与国内绝大部分分离株同属于Asia-1型，说明其他亚型的CDV毒株暂未在山东地区流行。分离到的绿脓杆菌和大肠杆菌致病性较强，是威胁毛皮动物的主要致病菌。综合认为，CDV与致病细菌的混合感染可能是导致这些地区毛皮动物大规模死亡的一个重要原因。