高效液相色谱-多波长荧光检测法同时检测多维生素片中维生素A和维生素E的含量

王世龙**

（南京医科大学附属老年医院，江苏 南京 210024）

维生素是维持人体正常生长发育和调节各种生理功能的必需物质，由于体内不能合成，必须从食物中摄取补充[1-2]。维生素A又称视黄醇，具有预防癌症、保持正常视觉、预防夜盲症、维持黏膜正常功能、增强抵抗力，维持骨骼和牙齿正常发育、令皮肤光洁滑嫩等功能；维生素E又称生育酚，结构复杂，具有促进生育、延缓衰老以及抑制肿瘤等功能，并对糖尿病并发症、动脉粥样硬化起到预防作用。维生素A和维生素E均为脂溶性维生素，化学性质不稳定，遇到空气、光照和温度影响易导致氧化分解[3-4]。

维生素A和维生素E的分析检测方法主要有层析法[5]、比色法[6]、色谱法[7-9]和质谱法[10-11]。层析法和比色法灵敏度偏低，操作过程繁琐；质谱法设备昂贵，测定过程需要加入同位素内标校正，仪器普及率较低，不宜推广；高效液相色谱法是检测维生素A和维生素E的主流方法，但紫外检测器响应值相对偏低，而维生素A和维生素E均有较强的荧光吸收，故本实验开发一种利用高效液相-荧光检测器检测多维生素保健品中的维生素A和维生素E的方法。结果表明，此法操作简单，灵敏度高，准确度高。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪：agilent1260 in finity主机（美国agilent）；检测器：G1321A荧光检测器（美国agilent）；色谱柱：WATERS SUNFIRE-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 µm) （美国WATERS）；电子天平：梅特勒XS204电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；超声仪：KQ-500DE型数控超声波清洗机（昆山超声仪器）；振荡器：HY-4型（天津泰斯特）。

1.2 标准物质

维生素A对照品（含量98.0%，批号100368-201502，中国食品药品检定研究院）；维生素E对照品（含量97.7%，批号100062-201110，中国食品药品检定研究院）。

1.3 试药

甲醇，乙腈：色谱纯；纯化水，自制（密理博制水器）；多维生素片（惠氏制药，批号20180107）；多维生素片（杭州民生药业，批号20171117）；多维生素胶囊（河北恒利集团制药公司，批号20180226）。

1.4 色谱条件

Waters SunFire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），柱温30 ℃，进样量25 µl，流速1.0 ml/min；流动相A：甲醇；流动相B：纯化水；维生素A测定波长：激发波长330 nm，检测波长475 nm；维生素E测定波长：激发波长295 nm，检测波长325 nm。

表1 梯度洗脱条件

1.5 溶液配制

1.5.1 对照品储备溶液 分别取对照品维生素A和维生素E各约100 mg，精密称定，置100 ml量瓶，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀。

1.5.2 标准曲线溶液 取1.5.1对照品储备溶液适量，分别用甲醇稀释制成浓度依次为0.3，1.0，2.0，5.0，10.0，30.0 μg/ml标准曲线溶液。

1.5.3 供试品溶液 取多维生素保健品（以多维生素片为例）20片，精密称定，研钵研成细粉；称取适量样品（根据样品中含量确定）置于100 ml棕色量瓶，加甲醇约70 ml，超声震荡5 min（超声频率55 Hz，功率60%）；放置至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀；取上述溶液，0.45 µm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液（实验注意避光）。

2 方法与结果

2.1 标准曲线及检出限

取1.5.2项溶液分别进样分析，以各对照品溶液的浓度（X）与其对应的峰面积（Y）做线性曲线，结果维生素A和维生素B在一定范围内均呈良好的线性关系；取对照品溶液，逐级稀释至各对照品色谱峰峰高分别达到3倍信噪比。得到维生素A和维生素E的检测限分别为0.08，0.10 μg/ml。结果见表2，典型谱图见图1。

表2 线性回归方程及相关系数

图1 典型谱图

2.2 加标回收率试验

取已知含量的供试品样品，分别加入适量的1.5项维生素A和维生素E对照品溶液，制备低、中、高3个质量浓度（相当于供试品溶液75%，100%和125%）供试品溶液，每个质量浓度制备3份。按1.4项色谱条件检测，结果表明，维生素A回收率约91.4%～104.2%；维生素E回收率约94.3%～105.2%。结果见表3。

表3 加样回收率实验结果

2.3 精密度考察

取已知含量的供试品样品，进行样品前处理，得供试品溶液。按1.4项色谱条件检测，同一样品连续进样6次，结果表明，维生素A测定结果的精密度相对标准偏差为1.61%；维生素E测定结果的精密度相对标准偏差为1.04%。

2.4 重复性与稳定性

已知含量的供试品样品，进行样品前处理，得供试品溶液。同法配制6份供试品溶液。按1.4项色谱条件检测，结果表明，维生素A测定结果的重复性相对标准偏差为2.32%；维生素E测定结果的重复性相对标准偏差为3.11%；取重复性溶液1份，室温下放置0，2，4，8，12，24 h，按1.4项色谱条件分析，测得维生素A和维生素E的峰面积的RSD为2.32%和3.19%，结果表明，在此实验条件下，供试品溶液能稳定放置24 h（避光条件下）。

2.5 应用

取不同厂家多维生素保健品共3份，按1.5.3项进行样品前处理，取续滤液按1.4项色谱条件分别进样分析，测定维生素A和维生素E的含量。结果见表4。

表4 样品检测结果

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

维生素A和维生素E极性相差较大，维生素A极性较强，而维生素E极性较弱。如果选用等度洗脱方式，会导致维生素A出峰过早或维生素E出峰较迟。故选择梯度洗脱方式，通过控制流动相的极性变化，调节两种待测物的出峰时间，保证两者有较好的分离度前提，尽量缩短分析时间。实验分别选择乙腈体系和甲醇体系对两种待测化合物进行洗脱。结果表明，选择乙腈体系时，维生素A洗脱速度较快，出峰时间3.213 min，与死体积有交叉，影响准确定量；选择甲醇体系时，维生素A和维生素E能较好分离，且甲醇相对于乙腈对实验人员及环境的影响更小，故最终选择甲醇体系作为流动相。

3.2 荧光检测波长的选择

取维生素A标准物质，用甲醇配制含有维生素A约3 μg/ml标准溶液。在荧光分光光度计上测定维生素A的激发波长和检测波长分别为330 nm和475 nm；同法取维生素E标准物质，用甲醇配制含有维生素E约3 μg/ml标准溶液。得到维生素E的激发波长和检测波长分别为295 nm和325 nm。相同条件下，测定试剂空白的影响，结果表明，试剂空白在上述激发波长和检测波长下无干扰。