鸢尾异黄酮的分离纯化及抑菌活性研究

赵华龙，毛 涵,2，王远平，王 露，汤新慧*

（1. 盐城师范学院 江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室, 江苏 盐城 224051；2. 南京工业大学 生物与制药工程学院, 江苏 南京 210009）

鸢尾（Iris tectorumMaxim）是一种传统的药用植物，属天门冬目，鸢尾科多年生草本，味苦、辛，性冷，有小毒，多生长于坡地、林缘及水边湿地，喜阳光充足的环境[1]。鸢尾的药用历史久远，《中华本草》记载[2]，鸢尾具有清热解毒、祛风利湿、消肿止痛等功效，可用于治疗跌打损伤、风湿疼痛、咽喉肿痛、食积腹胀、疟疾等病症，也可外用治痈疖肿毒、外伤出血。从鸢尾中分离出的多种天然产物中，黄酮类为其主要的化学成分。研究表明，鸢尾中发挥功效的主要有效成分为异黄酮[3]。鸢尾中含有丰富的异黄酮类，主要包括野鸢尾苷元、鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素等[4]，有广泛的生物活性。近年，对于鸢尾属植物中黄酮类成分的研究多集中于成分结构及生物活性，全新的化合物和多样的生物活性不断被发现，其中拥有多种生理功能的异黄酮日益受到关注。Xie等[5]从屋顶鸢尾中分离出2种新的异黄酮类化合物Iriskashmirianin A和Germanaism H，并发现其能抑制埃利希腹水癌（EAC）细胞系增殖，有显著的抗炎作用。Fang等[6]从鸢尾中分离出的异黄酮成分 Iritectol B和Iridobelamal A对人乳腺癌细胞（MCF7）和人恶性黑色素瘤细胞（C32）呈现出明显的细胞毒性，显示其一定的抗癌作用。Kang等[7]研究表明，鸢尾黄素 （tectorigenin）能通过激活ERK信号通路清除细胞内的活性氧和DPPH自由基，以防止脂质过氧化。然而目前对于鸢尾异黄酮是否具有抗菌作用鲜有报道。

鸢尾异黄酮的提取多集中于根茎，鸢尾叶中也含有丰富的异黄酮成分，开发鸢尾叶的价值有助于鸢尾的充分利用。本实验以鸢尾叶为原料，以醇提法提取鸢尾叶中的总黄酮，采用硅胶柱色谱结合高效液相色谱法对鸢尾异黄酮进行分离纯化和含量测定[8]，确定鸢尾异黄酮的最佳分离纯化工艺及含量测定条件，并考察鸢尾异黄酮体外抗菌活性，以期为鸢尾药用价值的进一步开发利用提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

野生鸢尾，采集于江苏省盐城市沿海滩涂，经盐城师范学院海洋与生物工程学院孙同兴教授鉴定为鸢尾科鸢尾属鸢尾（Iris tectorumMaxim.）全草；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（江苏省康华医药科技实业中心）；鸢尾苷对照品（纯度≥98%，德思特生物）；硅胶（试剂级，300～400目，烟台新诺）；甲醇：色谱纯，其他试剂均为分析纯。

UltiMate 3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）；IKA RV 10旋转蒸发仪（艾卡仪器设备）；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机（宁波新芝生）； UV-2000紫外分析仪（上海嘉鹏科技）；KQ-100DB数控超声波提取仪（昆山超声仪器）。

1.2 鸢尾异黄酮制备方法

鸢尾叶洗净，干燥，打磨成粉，称取鸢尾叶干粉10 g，以料液比1:25加入85%乙醇溶液溶解，置于超声波提取仪超声50 min，功率90 W。重复提取3次，抽滤，合并滤液。真空浓缩至约350 ml，加入等体积石油醚萃取，至石油醚无色，合并萃取液，继续真空浓缩至浸膏，移入冷冻干燥机内冻干，称重，得鸢尾异黄酮粗提物[9]。

1.3 鸢尾异黄酮分离纯化方法

1.3.1 柱层析洗脱剂的选择 以85%乙醇为溶剂[10]，将粗提物干粉定容至10 ml，混匀，制备鸢尾黄酮粗品醇溶液。分别以85%乙醇、乙酸乙酯-丙酮-无水乙醇（5:1:0.5）和乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5:2:1）为展开剂在硅胶G板上定距8 cm展开，以鸢尾苷作为对照品，265 nm波长紫外分析仪下显色，观察展开效果，选择合适洗脱剂。

1.3.2 硅胶柱层析分离纯化 采用湿法装柱，称取硅胶粉末20 g，洗脱剂浸泡30 min。取直径2.5 cm，柱长40 cm层析柱竖直固定，关闭底部活塞，将硅胶沿玻璃棒装入层析柱内，待硅胶自然沉降，排出洗脱剂，轻轻敲打柱壁使硅胶沉积压实。取1 ml样品溶液，沿层析柱内壁缓慢均匀加入，样品层上加一层脱脂棉轻轻压实。洗脱剂进行洗脱，每10 ml收集一份，依次编号。薄层层析（TLC）法检测收集的各管洗脱液，合并含鸢尾异黄酮的洗脱液。

1.4 鸢尾异黄酮含量和纯度测定

1.4.1 HPLC色谱条件 取适量鸢尾苷对照品和鸢尾异黄酮样品用色谱甲醇定容至10 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤制得对照品和样品溶液。使用C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相A为甲醇，B为0.4%磷酸，以A:B = 90:10（v/v）进行洗脱，流速1 ml/min，进样量20 μl，检测波长为265 nm。

1.4.2 标准曲线制作 取鸢尾苷对照品溶液20 μl 进行HPLC分析，记录峰面积，以对照品浓度（X，mg/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

1.5 鸢尾异黄酮抑菌试验

精密称取纯化后的鸢尾异黄酮配制浓度为0.625，1.25，2.5，5 mg/ml的样品溶液。分别以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作为指示菌，制备指示菌菌液，各吸取200 µl加至LB培养基平板涂布均匀，含菌浓度约l06cfu/ml。在平板上放置牛津杯，分别加入各组样品100 µl，空白样品作为对照，置于37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径[11]，每组设置3个平行实验。

2 结果与分析

2.1 样品分离纯化

根据鸢尾异黄酮易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸等有机溶剂的极性，配制合适比例的洗脱剂。鸢尾异黄酮的化学结构是以3-苯基苯并吡喃酮为母体的多羟基酚类，与雌二醇结构相似，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等极性溶剂，基本不溶于水[12]。故分别设置85%乙醇（洗脱剂I）、乙酸乙酯:丙酮:无水乙醇=5:1:0.5（v/v/v）（洗脱剂II）、乙酸乙酯:甲醇:甲酸=5:2:1（v/v/v）（洗脱剂III），TLC法对鸢尾异黄酮粗品溶液进行展开分析。结果表明，洗脱剂I展开拖尾现象较严重，且各组分不能充分展开。洗脱剂II和洗脱剂III（图1 A）对鸢尾异黄酮均有一定展开效果，且展开的各组分中有与对照品处于同一位置的斑点；其中洗脱剂II的展开效果较好，各条带分离较明显，故作为柱层析洗脱剂对鸢尾异黄酮进行分离纯化。

图1 鸢尾异黄酮薄层色谱图

以洗脱剂II对鸢尾总黄酮进行洗脱，洗脱组分分别用25 ml锥形瓶收集，每瓶10 ml，依次编号。洗脱结束后取1，2，4，7，9，11，13，15，17，19，22，24，26，29，31，34，37，40号收集液进行TLC分析，结果表明，4～19号收集液的薄层层析斑点与对照品斑点处于同一位置（图1B），合并与对照品斑点处于同一位置的收集液，真空浓缩至干，称重。

2.2 样品含量及纯度测定

2.2.1 线性关系考察 精密称取2 mg鸢尾苷对照品溶于20 ml 70%乙醇溶液，分别取0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9，1.0 ml定容至10 ml，摇匀，配制成系列浓度对照品溶液。以70%乙醇溶液为空白对照，在波长265 nm处测定吸光值，以鸢尾苷浓度为横坐标，各浓度吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得直线回归方程Y=1.5855X+0.0141，R2=0.9794，RSD=1.05%（n=5），表明鸢尾苷浓度在1～100 μg/ml范围内呈良好线性关系。

图2 鸢尾异黄酮HPLC色谱图

2.2.2 样品制备与测定 采用面积归一化法，测定鸢尾苷对照品的纯度。精密称取鸢尾苷对照品，用色谱甲醇配制浓度为0.1 mg/ml样品溶液，根据实验方法1.4.1中的HPLC色谱条件分析，结果表明，对照品为单峰（图2A），保留时间为1.53 min，用面积归一化法计算含量为99.76%，符合对照品含量测定使用要求。样品HPLC分析结果显示为单峰，保留时间1.55 min，与对照品基本一致（图2B）。根据HPLC测定结果，计算样品中鸢尾异黄酮的含量和纯度。

结果见表1，鸢尾异黄酮在总黄酮粗提物中的含量为620 mg/ml，纯度为15.28%，得率6.09%。纯化后的鸢尾异黄酮含量为167.4 mg/ml，纯度为91.29%，得率1.62%。

表1 鸢尾异黄酮含量和纯度

2.3 抗菌活性

分别以革兰阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰阴性菌大肠杆菌为指示菌，检测不同浓度鸢尾异黄酮的抗菌活性。结果见表2。不同浓度的鸢尾异黄酮对枯草芽孢杆菌均有一定抑菌效果，而0.625 mg/ml鸢尾异黄酮对大肠杆菌无抑菌作用，随着浓度增加，开始显示出一定的抑菌效果。

表2 牛津杯法实验结果

检测各处理组的抑菌圈直径，结果见表3。鸢尾异黄酮对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有一定程度抑制作用。鸢尾异黄酮对大肠杆菌最小抑菌浓度为1.25 mg/ml，对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度为0.625 mg/ml。

表3 不同浓度鸢尾异黄酮对不同菌种的抑制作用

3 讨论

异黄酮是一种弱的植物雌激素，其化学结构中B环连接于C3位上，分子间的作用力较大，导致脂溶性和水溶性较差，只能溶于一些有机试剂[15-17]。根据鸢尾异黄酮的这种结构特性，笔者分别尝试以不同比例的85%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、甲醇、甲酸等成分配制柱层析洗脱剂，发现以乙酸乙酯:丙酮:无水乙醇= 5:1:0.5（v/v/v）为洗脱剂分离效果最佳，其他条件均会出现分离不充分或不同程度的拖尾现象。在HPLC检测含量过程中，也探索了流动相。鸢尾中所含成分比较复杂，虽经柱层析分离各成分，但也有可能仍有杂质未充分分离，流动相不合适易造成出峰时间过长或分离效果不佳。笔者通过调节甲醇与0.4%磷酸比例，分别设置甲醇:0.4%磷酸比例50:50（v/v）、70:30（v/v）、80:20（v/v）、90:10（v/v）为流动相对样品进行梯度洗脱。结果表明，以甲醇:0.4%磷酸=90:10（v/v）为HPLC流动相，样品和对照品的峰型均为单峰，保留时间较为一致，分离效果较好。

药物浓度是影响抑菌效果的重要因素之一。对半稀释鸢尾异黄酮溶液建立浓度梯度样品溶液，实验过程中发现，在0.625～5 mg/ml范围内，随着浓度的增加，鸢尾异黄酮分别对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌呈现出一定的抑制效果，当样品浓度大于5 mg/ml时，各浓度的抑菌圈之间会形成交叉，影响试验结果的统计。而浓度小于0.625 mg/ml时，各抑菌圈之间并未呈现明显的差异。同时，鸢尾异黄酮表现出对枯草芽孢杆菌更明显的抑制作用，显示其对革兰阳性菌具有较为突出的抑菌效果。

综上所述，本研究通过柱层析-高效液相色谱法得到纯度较高的鸢尾异黄酮，通过抑菌试验证实其具有显著的抑菌活性，对于深入推广和研究鸢尾的药理作用具有一定的参考价值。