固相萃取-GC-MS法检测铁皮石斛药材中的5种常见农药残留

聂静苑

（长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410016）

铁皮石斛是兰科植物铁皮石斛加工后的干燥茎，因其喜好温暖湿润的气候和阴暗潮湿的环境，曾广泛分布于福建、浙江、云南等南方地区。铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热等功用[1-4]。医学研究发现，铁皮石斛具有抗肿瘤、降血糖、调节免疫功能、抗氧化及抗疲劳等多种药理作用。国家卫计委已于2018年1月将铁皮石斛列入食药同源名单。近年，由于铁皮石斛被长期无节制的采摘，野生铁皮石斛已成为濒危药材。目前市场上流通的铁皮石斛，主要来自人工栽培。随着铁皮石斛种植的产业化发展，人工栽培技术的大量应用，铁皮石斛的产量已基本满足人们的需要。然而栽培过程中，农药的滥用、超量使用问题日益严重，农药残留严重影响铁皮石斛的质量，铁皮石斛的质量安全问题已引起人们的广泛关注[5-10]。

有机磷类农药（OPP）是一种广谱、低廉、高效的杀虫剂，在杀虫、杀菌、除草、植物的生长调节中均有广泛应用，也是我国目前使用最多、应用最广的一类农药，其检测对于食品安全质量控制有积极意义。本文采用固相萃取-气相色谱-质谱法（GC-MS）对新鲜铁皮石斛中的5种有机磷农药残留量进行检测，为铁皮石斛的质量安全提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890B-5977B气相-质谱联用仪[安捷伦（中国）]；HP-5 MS色谱柱[安捷伦（中国）]；氨基固相萃取柱，容量为0.5 g/6 ml，上海安普）；全自动高通量平行浓缩仪（Lab Tech）；XS DU205型电子天平[梅特勒（中国）]；X1R高速冷冻离心机（Thermo）。

1.2 试药

环氧七氯（内标物），甲基对硫磷，杀螟硫磷，马拉硫磷，对硫磷，杀扑磷标准品（均为100 μg/ml）均购自农业部环境保护科学研究所；氯化钠：分析纯（国药集团）；乙腈，甲苯均为色谱纯（德国默克）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 准确称取已均质好的新鲜铁皮石斛样品20 g，置入 100 ml 离心管，加入乙腈40 ml，氯化钠4～6 g，匀浆提取2 min，5000 r/min 离心3 min，取上清10 ml，待净化。

取氨基萃取柱，先后用乙腈:甲苯（5:1）5 ml活化萃取柱，当淋洗液达到氨基柱顶部时，迅速将上述提取液10 ml转移至净化柱中，并用乙腈:甲苯（5:1）5 ml的分3次洗涤样液瓶，一并转移至净化柱中。将收集后的净化液置于60 ℃水浴中用氮吹仪吹至近干，用丙酮进行溶剂交换，最后使体积为1 ml，加入10 μg/ml环氧七氯内标液20 μl，混匀，用于色谱分析。

2.1.2 标准溶液的配制 将100 μg/ml 的5种农药标准品溶液分别用丙酮稀释至20 μg/ml浓度的混合标准储备溶液。准确移取适量，用丙酮稀释得0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 µg/ml系列浓度的混合标准工作溶液。取以上系列浓度的混合标准工作溶液1 ml至已吹至近干的空白样品基质中，加入10 μg/ml环氧七氯内标液20 μl，混匀，即为基质标准溶液。

2.2 色谱条件

毛细管色谱柱：HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流方式：不分流；进样口温度：260 ℃；氮气流量：2 ml/min；柱温：初始温度60 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速率升温至160 ℃，以5 ℃/min的速率升温至270 ℃，保持2 min。

2.3 质谱条件

离子源：电子轰击源（EI源）离子源；温度：220 ℃；接口温度：250 ℃； 溶剂延迟时间：1.5 min。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备及检出限测定 按2.2、2.3项色谱、质谱条件进样2.1.2项下基质标准溶液各1 μl，5种有机磷农药在线性范围内线性关系良好，相关系数（r）＞ 0.995。 以仪器3倍噪声比值（S/N）表1：甲基对硫磷（12.745 min）；2：杀螟硫磷（13.237 min）；3：马拉硫磷（13.412，8.031min）；4：对硫磷（13.712 min）；5：杀扑磷（14.792 min）

表1 5种有机磷农药的线性、相关系数及检出限

图1 基质标准溶液谱图

3 讨论

3.1 质谱条件的确定

根据质谱理论，样品测定时，若检出色谱峰的保留时间与标准品一致，且扣除背景后，待测样品的离子丰度比与标准样品的离子丰度比一致，则可定性确证这种农药的存在。本法测定中，配制4 µg/ml的5种标准溶液，根据以上色谱条件分别对5种有机磷农药进行全扫描，确定母离子峰及其保留时间，再通过不断更换碰撞能量对母离子进行碎片离子扫描。每种农药化合物分别选择一个定量离子，2个定性离子。以示方法的检出限，在该色谱条件下，5 种农药的检出限在0.001～0.006 mg/kg之间。5种有机磷农药的线性方程、相关系数及检出限数据见表1，基质标准溶液的谱图见图1。

2.4.2 加标回收及精密度试验 准确称取已均质好的新鲜铁皮石斛样品 20 g，置入100 ml离心管，加入最终质量浓度分别为0.02 µg/ml（低），0.1 µg/ml（中），0.5 µg/ml（高）3个水平的5种有机磷农药的混合标准溶液，按2.1.1项方法处理样品，每个水平的供试品溶液各3份，按2.2、2.3项色谱条件分析，得低、中、高3个浓度点的加标回收率，其中0.1 µg/ml浓度点的加标样品平行测定6次，6次精密度测定结果的RSD及加标回收率结果见表2。

表2 回收率及精密度测定结果

2.4.3 重复性试验 准确称取 已均质好的样品 20 g，置入100 ml 离心管，加入一定浓度的混合标准溶液，按2.1.1项方法对样品进行萃取和净化。同法处理6份样品，对样品进行分析测定，结果见表3。MRM模式对样品进行检测。5种有机磷农药定量离子和对应的两个碎片定性离子对见表4。

表3 重复性试验结果

表4 5种有机磷残留离子相关信息

3.2 萃取溶剂的选择

乙腈是农残检测时常用的提取液, 由于乙腈极性较大，研究发现较早洗脱的极性组分会发生裂分, 为了降低乙腈的极性, 在乙腈提取液中加入沸点相近的极性较弱的溶剂如甲苯等，使用乙腈:甲苯（5:1）作为洗脱溶剂，色谱峰峰形较好。

本实验建立了固相萃取-GC-MS同时测定铁皮石斛中5种有机磷农药残留的方法。对质谱条件和萃取溶剂进行了优化，分别考察了方法的重复性、精密度、回收率等。结果表明本方法的准确度、精密度、重复性均符合分析测试要求，可为铁皮石斛中农药残留的监测提供参考。