HPLC梯度洗脱法测定DEPBT的纯度

李云峰，魏振兴，郭 静，胡丽英

（常山凯捷健生物药物研发（河北）有限公司，河北 石家庄 050800）

3-(二乙氧基磷酰基)-氧-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮[3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotrizin-4(3H)-one，DEPBT]，是一种含磷肽缩合试剂，具有反应条件温和，底物氨基酸侧链羟基、咪唑基等官能团不需保护，产物消旋率低等优点。DEPBT不仅可用于生物活性多肽的合成，而且可以作为缩合试剂用于酰胺键的缩合反应[1-7]。本文参考相关质量标准及文献[8-11]建立了DEPBT纯度测定的HPLC方法，所建立的方法简便、快捷、结果稳定，可用于DEPBT的质量控制。

1 仪器与试药

U3000型高效液相色谱仪（美国Thermo公司，包括HPG-3X00型四元泵、WPS-3000型自动进样器、TCC-3X00型柱温箱、MWD-3000型检测器），分析天平（Mettler Toledo公司，XS105DU）。

DEPBT供试品（苏州昊帆生物，批号:20171001），DEPBT对照品（Sigma，批号：BCBV2309），乙腈（Fisher，批号：165738），三氟乙酸（阿拉丁，批号：I1620036），均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6 mm×25 cm，5 μm）； 柱温：30 ℃；进样体积：20 μl；检测波长：265 nm；样品室温度：5 ℃；流动相A：0.1%三氟醋酸水溶液，B：0.1%三氟醋酸乙腈溶液：流速：1.0 ml/min，按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液制备

对照品贮备溶液：取DEPBT对照品约50 mg，精密称定，置10 ml量瓶，加乙腈适量使溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。

对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液1 ml，置10 ml量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：取DEPBT供试品约12.5 mg，精密称定，置25 ml量瓶，加乙腈适量溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

空白溶液：乙腈。

2.3 系统适用性试验

精密量取对照品溶液20 µl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。DEPBT保留时间RSD应≤2.0%，峰面积RSD应≤2.0% 。

连续进样6次，DEPBT保留时间RSD为0.03%，DEPBT峰面积RSD为1.72%。

2.4 专属性试验

分别精密量取空白溶液、未破坏供试品溶液、酸破坏溶液（0.1 mol/L，盐酸30 min）、碱破坏溶液（0.1 mol/L，氢氧化钠1 min）、 高温（40 ℃，24 h）破坏溶液、光照（4500 lux，48 h）破坏溶液各20 µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果空白溶液对检测无影响；酸破坏与碱破坏溶液主要降解产物是未知化合物1（RRT0.7）；高温破坏溶液主要降解产物是未知化合物1（RRT0.7）和未知化合物4（RRT1.1）；光照破坏溶液较稳定。DEPBT峰与各降解杂质峰，以及各降解杂质峰间分离度均≥1.0，分离度良好，说明该方法专属性良好，图谱见图1～图6。

图1 空白溶液

图2 未破坏供试品溶液

图3 酸破坏供试品溶液

图4 碱破坏供试品溶液

图5 高温破坏溶液

图6 光照破坏溶液

2.5 线性试验

分别取对照品贮备溶液定量稀释制成每1 ml中含DEPBT 0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0 mg溶液，分别精密量取20 µl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以DEPBT峰面积为纵坐标，DEPBT浓度为横坐标，线性方程为y=101.6146x-0.2945，R2为1.0000，证明线性关系良好。

2.6 精密度

2.6.1 重复性 平行制备DEPBT供试品溶液6份，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算色谱峰纯度，色谱峰纯度应≥97.0%，6份样品色谱纯度RSD应≤2.0% 。结果，6份样品色谱纯度平均值为99.54%，RSD为0.31%。

2.6.2 中间精密度 取同一批样品，在同一实验室由另一实验人员换用另一台仪器，于不同时间重复2.6.1项下操作。结果，6份样品色谱纯度平均值为99.59%，RSD为0.17%。综合重复性、中间精密度结果计算供试品的平均色谱纯度为99.56%，RSD为0.21%。结果表明，本法精密度良好。

2.7 准确度

对照品溶液：取DEPBT对照品约12.5 mg，精密称定，置25 ml量瓶，加乙腈适量溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

80%供试品溶液：取DEPBT供试品约10 mg，精密称定，置25 ml量瓶，加乙腈适量溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

100%供试品溶液：取DEPBT供试品约12.5 mg，精密称定，置25 ml量瓶，加乙腈适量溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

120%供试品溶液：取DEPBT供试品约15 mg，精密称定，置25 ml量瓶，加乙腈适量溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

每个浓度供试品平行制备3份，以外标法计算各供试品溶液浓度，根据DEPBT加入量计算各浓度下回收率以及RSD，统计9份样品总回收率及RSD。结果见表2。

表2 准确度检测结果

2.8 耐用性

调整色谱条件，分别测定精密度试验同批次样品，以峰面积归一化法计算色谱纯度，以精密度测定色谱纯度的平均值为100%，其他条件测定的色谱纯度与平均色谱纯度进行比较，计算相对纯度。结果色谱条件微小改变后，相对峰纯度在99.75%～100.07%之间 ，说明色谱条件耐用性良好。结果见表3。

表3 耐用性试验检测结果

2.9 溶液稳定性

取2.6.1项下供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12，16，24 h精密量取20 µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以0 h进样纯度为100%，其他时间进样的相对峰纯度为99.74%～99.98%，DEPBT溶液在5 ℃时稳定性良好。结果见表4。

表4 溶液稳定性试验检测结果

2.10 定量限

取DEPBT对照品贮备液逐级稀释，进样，当浓度为0.5 μg/ml时信噪比大于10，即0.5 μg/ml为定量限浓度。

3 讨论

本实验曾采用三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70作为稀释液，结果DEPBT水解严重，24 h水解率为99.25%，结果见表5，图7，图8。将稀释液改为纯乙腈后，溶液在5 ℃时稳定性良好。

表5 三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70作为稀释液时稳定性结果

图7 稀释液为三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70稳定性0 h

图8 稀释液为三氟醋酸:乙腈:水=0.1:30:70稳定性24 h

专属性试验可见，DEPBT对温度特别敏感，为了消除温度对检测的影响，将样品室温度设为5 ℃，溶液稳定性考察结果表明，5 ℃时DEPBT稳定性良好。