中药材五灵脂特异性PCR鉴别方法的研究

马德源，谭晴晴，陈力群，刘艳艳，葛付存，王佩仪，步 迅，陈雪燕，张全芳*

（1. 山东省农业科学院 生物技术研究中心，山东 济南 250100；2. 山东师范大学附属中学，山东 济南250014；3. 山东百味堂中药饮片有限公司，山东 济南 250108；4. 山西广誉远国药有限公司，山西 晋中030800）

关键字：五灵脂；复齿鼯鼠；特异性；PCR；分子鉴定

要求，且相对误差大。DNA基因鉴定近年在中药鉴定中应用较为广泛,该技术能从基因层面鉴别药材,准确性较高[6]，而DNA条形码鉴定技术作为新兴的分子生物学鉴定技术，在中药材领域取得丰硕成果[7]。COI 为线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素 C 氧化酶亚基 I（cytochrome C oxidase subunit I），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。陈士林等[8]在大量实验的基础上提出了以COI基因为主、ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。由于五灵脂属复齿鼯鼠的干燥粪便，放置时间较长，DNA含量少，提取相对困难。利用动物通用引物COI序列进行鉴定，部分物种会出现不同程度套峰，致使检测结果不准确，且PCR扩增困难。本研究以五灵脂为研究对象，针对不同物种间序列差异性，利用线粒体16S rDNA基因片段对样本五灵脂为复齿鼯鼠（Trogopterus xanthipes）的干燥粪便，始载于《开宝本草》，云：“出北地。此是寒号虫粪也”[1]。五灵脂性味甘温，无毒，入肝经，具有疏通血脉、散瘀止痛的功效，主治血滞、经闭、腹痛、胸胁刺痛跌扑肿痛和蛇虫咬伤等症，是妇科要药[2]。然而，市场上部分药材存在掺假问题，如用红白鼯鼠、飞鼠科动物小飞鼠和黑白飞鼠、鼠兔科多种鼠兔的粪便冒充复齿鼯鼠的粪便，甚至部分不法分子利用小粪粒和沙粒及松树叶碎片伪制成灵脂块。这些伪品在外观和质地上都与真正的五灵脂极其相似，形态鉴别困难。

目前，对五灵脂真伪的鉴别主要通过形态学鉴定和有效成分检测鉴定。传统的形态学鉴定采用生药鉴别和显微镜检技术[3]，有效成分鉴定主要应用薄层色谱鉴别技术[4]和气相色谱-质谱联用分析技术[5]。这些传统方法对样品的完整度和干燥度有一定进行研究，通过分析比对相关序列，设计五灵脂特异性引物，旨在建立一种适用于中药材五灵脂动物基源成分鉴定的新分子标记方法。

表1 样品来源

1 仪器与材料

1.1 仪器

艾本德5333 PCR扩增仪（德国Eppendorf）；ABI 3700XL DNA测序仪（美国ABI公司）；5810多功能台式离心机离心机（德国Eppendorf）；ChemiDoc™ XRS+凝胶成像系统（Bio-Rad）。

1.2 材料

本研究所用的试验样品具体来源和信息见表1。市售的15个待测样品购自济南某中药市场。OMEGA Stool DNA 试剂盒（OMEGA公司）；Taq DNA聚合酶，10×缓冲液， dNTP [宝生物（大连）]。

2 方法

2.1 DNA样品提取

针对粪便DNA提取困难的特点，本试验采用3种方法提取五灵脂基因组DNA，并进行比较。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗样品2～3遍，加核酸裂解液消化，取上清，酚-氯仿抽提，然后分别按方法A、B、C处理。方法A[9]：向沉淀中加入 CTAB裂解液500 µl和蛋白酶K20 µl，混匀，55 ℃裂解2 h；12 000 r/min离心5 min，上清置入1.5 ml离心管，加等体积氯仿抽提，混匀，12 000 r/min离心10 min，反复抽提两次（离心后使水相和有机相之间不再有沉淀）；向上清中加0.1倍体积的3 mol/L醋酸钠，1.5倍预冷无水乙醇，混匀，-20 ℃放置30 min；12 000 r/min离心10 min，弃上清，室温干燥；向沉淀中加异硫氰酸胍洗液1 ml，摇匀至沉淀完全溶解；加硅珠悬液20 µl，缓慢振摇吸附DNA10 min，12 000 r/min离心1 min，弃上清；加70%乙醇700 µl重复洗涤沉淀2次；离心弃上清，56 ℃干燥10 in，加双蒸水40 µl洗脱DNA，离心后将上清置入新的离心管，-20 ℃保存待用。方法B[10]：向沉淀中加CTAB裂解液700 µl和蛋白酶K 20 µl，混匀，56 ℃裂解2 h；12 000 r/min离心10 min，上清置入1.5 ml离心管，加等体积氯仿抽提，混匀，12000 r/min离心10 min，反复抽提两次（离心后使水相和有机相之间不再有沉淀）；加2倍体积的DNA结合液和10 µl硅珠悬浮液，12000 r/min离心1 min；弃上清，加70%无水乙醇700 µl洗涤2遍；12000 r/min离心1 min，弃上清，56℃干燥10 min，加双蒸水 40 µl洗脱DNA，离心后将上清置入新的离心管，-20℃保存待用。方法C参考动物粪便提取试剂盒（OMEGA Stool DNA 试剂盒），具体操作步骤参照使用说明书。每份DNA样品分别取2 μl，用紫外线分光光度计测定其浓度及A260、A280。每个样品做3个生物学重复，取均值。并利用动物COI通用引物检测DNA质量。

2.2 引物设计

选择复齿鼯鼠的线粒体16S rRNA基因作为研究对象，在Genbank中查找该基因序列（登录号：AY227494.1）。采用Premier Primer 5.0软件设计特异引物，上游引物为Tr-16SF：5’-ACATTGACCTCTCCGTGAAGAG-3’，下游引物为Tr-16SR：5’-TTACACGATTTGGATGTCCTGAT-3’。通用引物COI序列扩增正向引物 HCO2198：5’-TAA ACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，反向引物LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3’。

2.3 PCR扩增和电泳检测

通过预实验对扩增条件和体系参数进行优化。PCR扩增采用25 µl体系，其中包括：10×Taq Buffer 2.5 µl，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 µl，Taq DNA聚合酶0.2 µl，上、下游引物（10 µmol/L）各1.0 µl，DNA模板2.0 µl，双蒸水补足至25 µl。PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。扩增结束后，取5.0 µl PCR扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察并拍照保存。

2.4 特异性引物检测

分别以从8份五灵脂、小家鼠粪便、黑白飞鼠粪便、红白鼯鼠、红耳鼠兔粪便和家兔粪便中提取的基因组DNA为模板，按2.3项优化的反应体系和反应条件进行PCR扩增，检测其Tr-16SF/R引物的特异性。

2.5 灵敏度检测

对所提取的五灵脂的DNA模板进行质量浓度测定，确定DNA浓度为44.35 ng/µl，按10倍梯度进行稀释（100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5），对所稀释的DNA模板采用相同的PCR反应体系和条件进行扩增，检测Tr-16SF/R引物的灵敏度。

2.6 数据分析

PCR扩增产物采用3730XL测序仪测序，然后将上下游序列通过Seq Man软件进行拼接，拼接结果经NCBI数据库Blast比对判断检测结果的准确性。

2.7 实际样本检测

利用本研究建立的PCR反应体系和条件对15份待测样本进行特异性检测。

3 结果

3.1 3种方法提取的基因组DNA纯度和浓度检测结果

结果见表2。由表2可见，方法B提取的DNA纯度、浓度均优于其他两种方法。

表2 3种方法提取的基因组DNA纯度和浓度检测结果

3.2 COI通用引物检测DNA模板质量

图1 COI通用引物的PCR扩增产物凝胶电泳检测图

利用COI通用引物对模板进行扩增，检测DNA提取质量。通用引物可扩增出一条约700 bp条带，见图1。由图1可见，提取的DNA质量均能达到扩增要求，可用于后续试验。

3.3 PCR扩增体系建立

对收集到的8个五灵脂样品进行特异性PCR检测，以无菌水和鼠属伪品作为阴性对照，见图2。结果显示，五灵脂为阳性，扩增出预期340 bp左右的条带。扩增产物测序结果见图3。扩增序列拼接后进行Blast分析，结果显示所扩增的序列与复齿鼯鼠的相似度99%，说明本方法能快速检测出五灵脂。

图2 五灵脂特异性引物的PCR扩增产物电泳检测图

图3 五灵脂特异性引物的PCR扩增产物测序序列峰图

3.4 特异性检测

对收集到的13份样品，按建立的特异性PCR方法进行鉴别，结果见图4。由图4可见，1～8号有扩增条带，且非常清晰，纯度较高，鉴定为正品五灵脂；其他样品无条带，扩增结果为阴性，鉴定为非五灵脂正品。

图4 五灵脂特异性验证电泳检测图

3.5 灵敏度检测

灵敏度检测结果见图5。由图5可见，当DNA模板浓度稀释至4.43 ng/µl时，特异性条带扩增明显且单一，当DNA浓度稀释至0.443 ng/µl时，能微弱地看出扩增条带但相对模糊，之后的稀释模板均无扩增条带产生。由此说明五灵脂特异引物的检测灵敏度达4.43 ng/µl。

图5 五灵脂特异性引物灵敏度检测图谱

3.6 实际样品检测

对15份待测样本进行特异性PCR检测，结果显示，10份样本检测出复齿鼯鼠源性，5份样本未检出复齿鼯鼠源性成分，见图6。

图6 市场盲样检测凝胶电泳图

4 讨论

五灵脂是粪便类中药材，由于保存时间长短不一且DNA降解严重，陈旧的粪便很难提取到高质量的DNA，而DNA提取的质量直接影响到后续PCR扩增及相关分子检测工作。由于粪便的干燥程度不同，提取过程中无法通过刮取表面黏稠层，洗脱表面表皮细胞进行提取，只能将粪便捣碎混匀，吸取少量的样品进行DNA提取。通过这种方法收集的细胞很少，且带有大量的杂质。目前对于粪便提取常用的方法有试剂盒法、常规提取法、Chelex-100煮沸法和硫氰酸胍裂解法[11]。本研究根据五灵脂的特点，在DNA提取前先用PBS冲洗2～3次，直至冲洗液颜色变浅，从提取的基因组DNA浓度看，方法B的提取浓度高于方法A和C，且纯度高，能很好地扩增出目的片段，满足后续实验的要求。同时，方法B相对于方法A、C耗时较短且操作简单。方法A虽然也能获取较高浓度的基因组DNA，但耗时较长，方法C属于试剂盒提取，试剂费用相对较高。五灵脂在干燥或成粉末后特征不明显，通过传统方法很难鉴定。随着分子生物学的发展，基源鉴定成为中药标准化和重要研究的基础[12]。本研究结果表明，引物Tr-16SF/R对五灵脂的检测有较强的特异性，应用该引物可实现其近缘物种快速准确鉴别，且不受材料完整度、干燥程度的影响。