破壁灵芝孢子粉对环磷酰胺致小鼠免疫抑制的调节作用

张 雯，宋俊科，王海港，周启蒙，王晓波，杜冠华

（中国医学科学院 & 北京协和医学院 药物研究所，北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京100050）

灵芝是一种传统名贵药材，也是可食用真菌，具有安神益气、活血益筋、止咳平喘、扶正固本等功效。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的细小颗粒，富含人体必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物碱和三萜类等物质，具有抗肿瘤、免疫调节和保肝降糖等多种功能[1-2]。灵芝孢子有两层质地坚硬、耐酸的孢壁，阻碍机体的消化吸收，因此灵芝孢子需破壁服用[3-4]。

灵芝对免疫力的调节作用已有报道，但对破壁前后灵芝孢子粉的作用差异尚缺乏充分的认识。环磷酰胺（cyclophosphamide）是医学上常用的抗癌药，也是常用的免疫抑制剂，可用于建立免疫低下的动物模型[5-6]。本实验应用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）测定破壁与不破壁灵芝孢子粉中灵芝酸A、C2、和D的含量，以环磷酰胺免疫低下小鼠作为模型动物，考察破壁机处理灵芝孢子粉对环磷酰胺所致免疫抑制的调节作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JYL-Y8 PLUS营养破壁调理机（九阳）；JYL-C051料理机（九阳）；Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent 6110单四级杆质谱仪（美国Agilent）；CascadaTMLS water纯水仪（美国Pall）；Spectra Max M5酶标仪（美国Molecular Devices）；荧光倒置显微镜（日本Nikon）；XS105 DU电子天平（瑞士Mettler Toledo）；Vortex Genie 2涡旋震荡仪（美国Scientific Industries）；MiniSpin常温离心机（德国Eppendorf）。

1.2 材料

灵芝孢子粉（北京协和药厂）；环磷酰胺（山西普德药业）；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的CD3+（FITCCD3+），藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的CD8+（PE-CD8+），藻红蛋白（phycoerythrin，PE）-菁类染料（cyanine，Cy5）偶联标记的CD4+（PE-CY5-CD4+）（美国BD）；RPMI-1640细胞培养液，胎牛血清（美国Gibco）；红细胞裂解液（碧云天）；噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美国Sigma Aldrich）；小鼠免疫球蛋白IgG、IgM ELISA试剂盒（武汉华美）。

1.3 动物

KM小鼠（SPF级），雄性，30～32 g[北京斯贝福实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002]。饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心（No. 00000804），自由摄食饮水，室温22±1 ℃，相对湿度55～65%，12 h光照周期。所有动物的饲养和实验过程均按照中国医学科学院药物研究所实验动物伦理委员会的指导方针。

2 方法

2.1 灵芝孢子粉处理

准确称取30 g灵芝孢子粉，加400 ml水，用破壁调理机处理，转速10级，时间20 s/次，共4次。准确称取30 g灵芝孢子粉，加400 ml水，用料理机处理，默认转速，时间20 s/次，共4次。分别得破壁灵芝孢子粉混悬液和非破壁灵芝孢子粉混悬液。

2.2 破壁与非破壁灵芝孢子粉离心后沉淀重量比较

离心管称重，分别加入破壁及非破壁处理的灵芝孢子粉混悬液5 ml，称重，1000 r/min离心10 min，弃上清，再次称重，计算沉淀重量。

2.3 化合物检测

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温30 ℃，进样量10 μl，检测波长288 nm，流动相为0.02%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用负离子检测模式，分别采用全扫描模式和单离子监测模式对潜在化合物灵芝酸A、C2、D进行预测。

质谱检测参数为碎裂电压150 V，增益1.5，干燥气流速度10.0 L/min，喷雾气压力35 psig，干燥气温度350 ℃，毛细管电压 3000 V（正模式），3000 V（负模式）。单离子监测模式监测的m/z见表2。

表2 单离子监测模式检测的离子m/z和对应的目标化合物

2.4 模型制备及分组

昆明小鼠80只，随机分为正常对照组、模型组、非破壁灵芝孢子粉组（750 mg/kg）和破壁灵芝孢子粉组（750 mg/kg）。除正常对照组外其余3组腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，连续注射3 d。从第4天起开始给药，各给药组每天灌胃给予相应的药物溶液，10 ml/kg，每天1次，连续28 d。正常对照组和模型组给予等容积的灭菌水。

2.5 自主活动测定

将小鼠放入自主活动箱中，测定前每只小鼠先适应环境1 min，再由记录仪自动记录3 min内小鼠自发活动次数。

2.6 免疫球蛋白及T细胞亚群测定

采用ELISA法测定血清IgG和IgM水平。每只小鼠取全血样50 μl，加入红细胞裂解液500 μl，然后轻轻吹打均匀，2 min后800 r/min离心5 min，弃去上层红色液体，离心洗涤两次。加入50 μl生理盐水重悬后分别加入CD3+、CD4+、CD8+抗体各1 μl，室温下避光静置15 min，加入450 μl生理盐水轻吹混匀，上流式细胞仪检测。

2.7 骨髓有核细胞计数测定

取小鼠一侧完整股骨，除净软组织，用PBS将全部骨髓冲洗至离心管，过200目细胞筛，定容至5 ml。计数板计数，并计算绝对数量[7]。

2.8 免疫器官指数及淋巴细胞增殖的测定

无菌取脾和胸腺，清洗血迹并吸干水分，称重，计算脏器指数。置于2 ml RPMI-1640细胞培养液中，200目细胞筛中研磨，收集细胞，后加入10 ml PBS，1000 r/min离心10 min，重复两次。弃去上层溶液，加入6 ml红细胞裂解液，吹打均匀，1500 r/min离心10 min，弃去上层溶液。加3 ml RPMI-1640细胞培养液，吹打均匀。以含10% FBS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106个/ml，铺96孔板。设置加刺激组和对照组，刺激组加入ConA（终浓度为5 μg/ml）或LPS（终浓度为10 μg/ml），对照组加入等体积RPMI-1640细胞培养液。48 h后MTT染色，计算T淋巴细胞和B淋巴细胞相对增殖指数。

2.9 数据统计处理

3 结果

3.1 破壁与非破壁处理灵芝孢子粉离心后沉淀物重量比较

破壁灵芝孢子粉的沉淀重量较不破壁灵芝孢子粉的沉淀重量轻（P＜0.05），表明经破壁处理的灵芝孢子粉有更多物质混悬到溶液中，导致其沉淀重量较轻，见表3。

表3 破壁与非破壁处理灵芝孢子粉悬液离心后沉淀重量比较（±s，n=6）

表3 破壁与非破壁处理灵芝孢子粉悬液离心后沉淀重量比较（±s，n=6）

注：*P＜0.05 vs 非破壁组

非破壁/mg 破壁/mg 1180.7±141.1 1012.7±59.6*

3.2 HPLC-MS比较破壁与非破壁灵芝孢子粉中化合物含量差别

结果见表4。由表4可见，破壁灵芝孢子粉中灵芝酸A、C2、D的释放量显著高于非破壁灵芝孢子粉中的释放量（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。

表4 破壁与不破壁灵芝孢子粉中灵芝酸A、C2、D相对含量比较（±s，n=6）

表4 破壁与不破壁灵芝孢子粉中灵芝酸A、C2、D相对含量比较（±s，n=6）

注：***P＜0.001 vs 非破壁组

非破壁组相对含量/% 破壁组相对含量/%灵芝酸A 98.41±4.96 116.54±3.47***灵芝酸C2 97.70±5.92 110.13±10.34***灵芝酸D 103.44±7.55 117.76±2.25***

3.3 灵芝孢子粉对小鼠存活率的影响

连续统计31 d内各组小鼠死亡情况，模型动物死亡率为35%（7/20），非破壁灵芝孢子粉治疗组动物死亡率为25%（5/20），破壁灵芝孢子粉治疗组动物死亡率为20%（4/20），破壁与非破壁灵芝孢子粉组动物死亡率差异无统计学意义。

3.4 灵芝孢子粉对小鼠自主活动的影响

测定各组小鼠自主活动次数，结果见图1，各组间差异无统计学意义。

图1 小鼠自主活动次数（n=10）

3.5 灵芝孢子粉对小鼠胸腺、脾脏指数的影响

结果见表5。由表5可见，与正常组相比，模型组小鼠胸腺、脾萎缩变小，胸腺指数和脾指数均显著降低（P＜0.001，P＜0.001）。与模型组相比，破壁灵芝孢子粉给药治疗组胸腺指数显著升高（P＜0.01）。非破壁灵芝孢子粉给药治疗组胸腺指数与模型组相比，差异无统计学意义。说明破壁灵芝孢子粉给药治疗能显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数，非破壁给药组无此作用。两个给药治疗组脾指数均有升高趋势，但差异无统计学意义。

表5 胸腺、脾脏指数（±s，n=6）

表5 胸腺、脾脏指数（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 对照组；**P＜0.01 vs 模型组

胸腺指数 脾指数对照组 1.49±0.42 5.12±0.76模型组 0.66±0.27### 3.54±0.88###非破壁组（750 mg/kg） 0.89±0.29 3.71±0.56破壁组（750 mg/kg） 1.05±0.34** 3.94±0.86

3.6 破壁灵芝孢子粉增加小鼠骨髓有核细胞

结果见表6。由表6可见，与对照组比较，模型组股骨有核细胞绝对数值显著降低（P＜0.001）。与模型组相比，破壁灵芝孢子粉给药治疗能显著提高股骨有核细胞绝对数值（P＜0.05）。非破壁灵芝孢子粉给药治疗对骨髓有核细胞数无显著影响。说明破壁灵芝孢子粉的治疗作用优于非破壁灵芝孢子粉。

表6 骨髓有核细胞绝对数值（ ±s，n=6）

表6 骨髓有核细胞绝对数值（ ±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 对照组；*P＜0.05 vs 模型组

骨髓有核细胞数（×106）对照组 13.18±1.81模型组 6.8±1.35###非破壁组（750 mg/kg） 8.57±0.86破壁组（750 mg/kg） 9.17±1.23*

3.7 灵芝孢子粉对小鼠淋巴细胞增殖的作用

结果见表7。由表7可见，与正常组相比，模型组的刺激指数均显著降低（P＜ 0.001），即腹腔注射环磷酰胺能显著抑制机体T、B淋巴细胞的增殖。与模型组相比，破壁与非破壁灵芝孢子粉治疗均能显著提高T淋巴细胞的增殖指数（P＜0.05，P＜0.05）。破壁灵芝孢子粉能显著提高B淋巴细胞的增殖指数（P＜0.01）。非破壁灵芝孢子粉给药治疗对B淋巴细胞增殖指数无显著影响。

表7 淋巴细胞增殖指数（±s，n=6）

表7 淋巴细胞增殖指数（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 对照组；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型组

T淋巴细胞增殖指数 B淋巴细胞增殖指数对照组 0.8±0.09 0.38±0.03模型组 0.31±0.05### 0.1±0.03###非破壁组（750 mg/kg） 0.46±0.09* 0.15±0.03破壁组（750 mg/kg） 0.47±0.08* 0.19±0.06**

3.8 破壁灵芝孢子粉调节外周血中T细胞亚群

结果见表8。由表8可见，与正常对照组相比，环磷酰胺可显著下调CD3+和CD4+T细胞亚群的比例（P＜0.001，P＜0.01），降低CD4+/CD8+T细胞比值（P＜0.001），上调CD8+T细胞亚群的比例（P＜0.01）。与模型组相比，破壁灵芝孢子粉给药治疗能显著抑制CD3+、CD4+的降低（P＜0.001，P＜0.01），显著降低环磷酰胺所致CD8+（P＜0.01）的升高，调节CD4+/CD8+T细胞比值（P＜0.01）。非破壁灵芝孢子粉给药组CD3+的比例和CD4+/CD8+的比值均显著低于破壁处理组（P＜0.01，P＜0.05）。

表8 外周血中T细胞亚群（ ±s，n=6）

表8 外周血中T细胞亚群（ ±s，n=6）

注：##P＜0.01，###P＜0.001 vs 对照组；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs 模型组；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs 破壁组

CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+对照组 72.19±5.23 64.52±5.06 19.77±1.01 3.26±0.90模型组 53.52±4.49### 43.39±5.50## 30.41±2.00## 1.44±0.48###非破壁组（750 mg/kg） 56.83±4.04&& 50.87±6.73 26.15±3.56 1.95±0.52&破壁组（750 mg/kg） 66.13±4.25*** 61.32±3.59** 21.78±1.74** 2.83±0.24**

3.9 破壁灵芝孢子粉增加血清中IgG和IgM的含量

结果见表9。由表9可见，环磷酰胺模型组小鼠血浆免疫球蛋白IgG和IgM水平均显著低于对照组（P＜0.001，P＜0.001）。与模型组相比，非破壁灵芝孢子粉能提高小鼠血清中IgM的含量（P＜0.05），对小鼠血清中IgG含量没有明显影响。破壁灵芝孢子粉治疗组能显著提高IgG（P＜0.05）和IgM（P＜0.01）的水平。

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 对照组；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型组

IgG IgM对照组 1297.5±236.18 615.67±35.46模型组 602.33±244.57###309.67±64.49###非破壁组（750 mg/kg） 882.8±128.2 414.27±65.05*破壁组（750 mg/kg） 925.19±93.35* 468.49±80.16**

4 讨论与结论

灵芝孢子有两层耐酸碱的坚硬壁状结构，只有经过破壁的灵芝孢子才利于人体吸收利用，发挥其药理活性，尤其是免疫活性[3-4]。灵芝酸A、灵芝酸C2和灵芝酸D均是三萜类物质，是灵芝中的主要活性化合物。但灵芝孢子的破壁目前除了工业化处理外，尚没有简易的方法，使灵芝孢子的应用受到限制，也导致大量灵芝孢子虽被使用，但没有发挥相应作用。

本实验结果表明，应用破壁机，可实现对灵芝孢子的破壁，使其释放更多的营养物质，其中破壁灵芝孢子粉中的灵芝酸A、灵芝酸C2和灵芝酸D均显著高于非破壁灵芝孢子粉中的对应物质。

免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能[8-9]。目前，人们普遍认为机体的健康状况及寿命的长短与免疫功能息息相关。当机体免疫功能下降或受抑制时，不能有效地识别并清除突变的细胞及外来细菌、病毒等，肿瘤及感染性疾病发生率增高[10-12]。因此，提高自身免疫力成了人们关注的话题，开发安全的具有免疫增强作用的功能性食品成为研究热点[13-16]。

环磷酰胺是较强的烷化剂，可引起骨髓造血抑制和免疫抑制。实验小鼠腹腔注射80 mg/kg环磷酰胺后，小鼠存活率显著降低，免疫器官萎缩变小，股骨有核细胞绝对数值显著降低，脾脏、胸腺的T、B淋巴细胞活性均受到不同程度抑制，且免疫球蛋白IgG和IgM含量降低。由此可见应用环磷酰胺腹腔注射小鼠造成免疫功能低下模型，可用来观察不同破壁模式下灵芝孢子粉对免疫功能的影响。

连续28 d分别灌胃给予两组实验小鼠破壁灵芝孢子粉和非破壁灵芝孢子粉（750 mg/kg）。与模型组相比，破壁灵芝孢子粉给药治疗组能提高小鼠存活率，显著提高小鼠胸腺指数，股骨有核细胞绝对数值显著升高，且能显著抑制环磷酰胺导致的T淋巴细胞及B淋巴细胞增殖转化率的降低，显著提高小鼠血浆免疫球蛋白IgG和IgM水平。与模型组相比，非破壁灵芝孢子粉给药治疗对小鼠胸腺指数、脾指数、股骨有核细胞数、B淋巴细胞增殖转化率、免疫球蛋白IgG均无显著影响，仅能有效抑制环磷酰胺导致的T淋巴细胞增殖转化率的降低、显著提高小鼠血浆免疫球蛋白IgM水平。

T淋巴细胞主要介导细胞免疫，在体内参与特异性免疫，它不仅是细胞免疫功能的承担者，也是免疫应答的调节者。其中CD3+包括外周所有成熟T细胞，代表细胞免疫的总体水平[12,17]。CD4+细胞代表辅助/诱导性T细胞（Th），CD8+细胞代表抑制/杀伤性T细胞（Ts），二者在体内维持一定的比例，共同参与免疫应答过程。本实验中，磷酰胺可显著下调CD3+和CD4+T细胞亚群的比例，降低CD4+/CD8+T细胞比值，上调CD8+T细胞亚群的比例。破壁灵芝孢子粉给药治疗组能调节免疫低下小鼠的淋巴细胞比例，对细胞免疫功能有恢复作用。

以上结果显示，经破壁处理的灵芝孢子粉对小鼠的免疫功能有较明显的促进作用，与非破壁灵芝孢子粉相比，作用明显增强。这为免疫力低下患者提供了一种行之有效的中药有效成分食用方法。