反相高效液相色谱法测定不同产地忧遁草中夏佛塔苷的含量

刘 梦，林 强

（北京联合大学，北京 100191）

忧遁草为爵床科（Acanthaceae）鳄嘴花属鳄嘴花Clinacanthus nutans(Burm. F.) Lindau 的全草。别名千里追、柔刺草、汉帝草、沙巴蛇草，印尼民众称之为Sambung nyawa。主要分布于中南半岛、马来半岛以及我国的南部和西南部。有报道称2011年因马来西亚某癌症患者服用忧遁草后康复，于是忧遁草的药用价值获得关注。研究表明，忧遁草有良好的抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫调节的生物活性[1-4]，其中黄酮碳苷类物质有降血糖、防辐射、抗菌杀虫、抗病毒及对肝脏心脑血管的保护多种生理活性[5]。黄丹民[6]研究忧遁草中黄酮碳苷类化合物发现，夏佛塔苷是忧遁草中含量最高的黄酮类化合物，并将其含量作为忧遁草质量控制的指标。人工种植的忧遁草由于环境和气候变化，其主要成分将有较大变化。本文检测国产和印度尼西亚两种忧遁草中夏佛塔苷含量，以此为中药和保健食品开发选材及不同地区选材标准的制定奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Adventurer AR1140电子天平（奥豪斯，精密度万分之一），Christ Alpha 1-2 LD plus冷冻干燥机（德国CHRIST公司），Rotavapor R215旋转蒸发仪（瑞士BUCH公司I），KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，色谱醇、双蒸水均经0.45 μm滤膜过滤。夏佛塔苷对照品（livingbio，批号：170413，纯度≥98%），忧遁草样品（中国海南人工种植，印度尼西亚巴芝丹人工种植）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 取10 mg夏佛塔苷对照品，用50%甲醇溶解定容至25 ml量瓶，配成0.4 mg/ml夏佛塔苷对照品溶液，用0.45 μm滤膜过滤备用。

图1 对照品和供试品色谱图

2.1.2 供试品溶液 取国产忧遁草、印度尼西亚忧遁草各3 g，分别用60 ml 50%甲醇溶解，超声提取30 min，旋蒸浓缩，冻干称重。取适量的冻干粉末溶于2 ml 50%甲醇溶液，用0.45 μm滤膜过滤备用。

2.2 色谱条件

采用Diamonsil C18(2)色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A相为0.1%乙酸水溶液，B相为甲醇，等度洗脱：0～60 min 24% B，流速1 ml/min, 柱温30 ℃，检测波长272 nm。在上述色谱条件下对照品及供试品的色谱图见图1（横坐标为出峰时间，纵坐标为吸光度）。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液15，20，25，30，35，40 μl，按上述条件分别注入液相色谱仪测定，以夏佛塔苷含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y= 1 874 481X– 635 065，R²=1 。结果表明，夏佛塔苷在5.88～15.68 μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液25 μl，连续进样6次，测得夏佛塔苷的峰面积RSD为0.26%，结果表明，进样精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密称取国产忧遁草提取物0.0148 g，用2 ml 50%甲醇溶解，滤膜过滤，分别在室温放置0，2，4，8，12，16，24 h，进样测定夏佛塔苷峰面积。峰面积RSD为1.49%。结果表明，供试品溶液室温放置24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取适量国产忧遁草提取物6份，用2 ml 50%甲醇溶解，滤膜过滤，在上述色谱条件下进样25 μl，测定夏佛塔苷含量，结果表明，夏佛塔苷平均含量为9.99 mg/g，其RSD为0.13%。

2.7 加样回收试验

取6份已知含量的国产忧遁草提取物，精密称定，分别精密加入对照品溶液（浓度为0.4 mg/ml）2 ml，按2.2项下方法，依次测定夏佛塔苷的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8 样品测定

取国产忧遁草和印度尼西亚忧遁草提取物适量，用50%甲醇溶解，用滤膜过滤，制备2份供试品溶液，按2.2项下方法，依次测定夏佛塔苷的含量，采用外标法计算。结果见表2。

表2 样品中夏佛塔苷含量的测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相选择

比较甲醇-水、乙腈-水等流动相。结果表明，甲醇-水系统对忧遁草样品的分离效果最好，甲醇-水系统夏佛塔苷峰拖尾严重，峰型差，可能因为夏佛塔苷结构中含有较多的醇羟基和酚羟基，羟基电离影响了分离效果，加入乙酸起到离子对抑制作用，峰型较优[7]。通过等度洗脱和梯度洗脱的比较发现等度洗脱可以使忧遁草样品达到较好的分离效果，经过多次尝试，最后选用等度洗脱。

3.2 波长的选择

对夏佛塔苷对照品溶液扫描，发现其最大吸收波长在270 nm附近，参照《中国药典》（2015年版）广金钱草中夏佛塔苷的检测波长[8]，最后选择272 nm作为检测波长。

3.3 提取溶剂的选择

参考夏佛塔苷测定的文献[9]，考察40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇提取效率，结果表明，50%和60%甲醇明显优于40%甲醇，综合考虑经济成本及毒性，最后选用50%甲醇提取。

4 结论

结果表明，国产忧遁草中夏佛塔苷的含量明显地高于印度尼西亚产的忧遁草。夏佛塔苷作为一种已知的含量最多黄酮碳苷类化合物，其含量的高低直接影响到忧遁草的功效。但忧遁草中黄酮种类较多，其他黄酮成分的含量与功效还有待进一步研究。有研究对马来西亚Negeri Sembilan，Johor和Perak三个地区的忧遁草中四种黄酮碳苷类化合物的含量[10]，其中夏佛塔苷的含量均低于国产忧遁草，国产和印尼忧遁草的功效高低还需进一步研究。