地塞米松对小鼠颅颌面部发育的影响*

王浩宇 王 恬 程燕宇 魏 仑 高福禄 吴靖芳△

(河北北方学院,1 组织学与胚胎学教研室,2 临床医学本科,张家口 075000;3 河北师范大学生命科学学院,石家庄 050024)

唇腭裂是颜面部较常见的先天性畸形,并可伴随邻近组织器官的发育障碍,如鼻和上下颌骨的发育畸形。目前认为腭裂的发病机制是基因与环境因素相互作用的结果,其中药物毒理研究表明,胚胎致畸敏感期药物可诱发唇腭裂。地塞米松(dexamethasone)可导致胎儿发育畸形。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2基因的作用主要是针对骨及其相关组织的生长发育,诱导骨祖细胞向骨细胞分化和发育[1]。甲状腺转录因子(thyroid transcription factor,TTF)-2基因的作用主要是针对甲状腺和腭的生长发育,若此基因发生突变可相应地使甲状腺发育障碍和腭裂的形成[2]。TTF-2基因对人也有类似的作用[3-4]。本研究通过地塞米松诱导胎鼠腭裂模型,应用体视学显微镜观察胚胎各时期的形态学变化,为进一步探讨地塞米松对胎鼠发育的影响提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

地塞米松磷酸钠注射液(郑州卓峰制药),BMP-2兔抗小鼠抗体(Bioworld technology公司,美国,型号BS3473);TTF-2兔抗小鼠抗体(Bioworld technology公司,美国,型号BS2240),SP免疫组织化学试剂盒,DAB显示试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 小鼠腭裂模型的建立

取健康成年昆明白小鼠,雄鼠24只,雌鼠48只,购自河北北方学院动物中心,于前一天下午6：00雌雄比例为2∶1合笼,次日早上7：00检查雌鼠,发现阴栓之日定为孕期第零天。平均分为实验组和对照组,实验组在孕期11.5d腹腔注射地塞米松50mg/kg诱导腭裂动物模型,对照组以等量的生理盐水代替。两组小鼠的饲养条件相同,于孕期14.5、15.5、16.5d脱颈处死孕鼠取胎鼠并记录总胎数、活胎数和死胎数。将胎鼠放入PBS冲洗,放入Bouin固定液中固定24h后进行后续实验。

胎鼠头颅侧貌测量：将全部胚胎置于体视学显微镜下拍摄头颅侧位像,随后在镜下检测腭裂发生,剔除实验组中发育正常的胚胎。参照蔡志刚等[5]的研究方法,进一步在软件中进行头颅侧位软组织侧貌测量研究(图1)。BF：下颌体长度;∠NAK：上颌突角;∠NBD：下颌突角;∠ABD：上下颌关系角。

为保证定点的准确性,选择下颌骨下缘延伸线L为基准线,参考口裂平面和下颌下缘平面,L的确定相对恒定。A：上唇最突点;B：下唇最突点;N：鼻根点;E：口角点;N：鼻额切线上鼻突点;L：下颌下缘延伸线;LL：口裂延伸线;AK、BD、NG、LL均平行于L;EF⊥BD。

1.3 H-E染色观察腭部形态学变化

通过脱水、透明、浸蜡及定向包埋;冠状位切片(以麦克尔软骨为基准)，切片厚5μm;常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇至水化,对标本行H-E染色,置于光镜下观察腭部的组织学变化。

1.4 免疫组织化学显色法检测BMP-2和TTF-2在鼻中隔软骨中的表达

切片脱蜡至水,用0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液水浴加热修复,室温放置30min;3% H2O2室温孵育10min,正常山羊血清封闭,室温孵育30min,倾去血清,滴加适当比例一抗(1∶100)湿盒孵育4℃过夜;

二抗37℃孵育30min;DAB溶液显色,苏木精染液复染,盐酸乙醇蓝化,二甲苯透明,中性树胶封片。

各组随机选取8张载玻片,每张载玻片在光学显微镜(×400倍)下随机取5个非重叠视野,用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对数据进行分析。鼻中隔软骨BMP-2和TTF-2表达阳性细胞为胞质呈棕黄色。根据细胞染色强度与染色细胞所占面积的比积分吸光值(integral absorbance,IA值)对结果进行分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 胚胎腭裂的发生情况(表1)

腭裂发生率统计结果显示(表1)，GD11.5d腹腔注射地塞米松50mg/kg诱导腭裂发生率大于50%，于GD14.5d、GD15.5d和GD16.5d取材胎鼠的腭裂发生率无差别，3组与同期对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组胎鼠的腭裂发生率(%)Tab 1 The incidence of clefe palate of each group (%)

**P<0.01vscontrol

2.2 头颅软组织侧貌分析(图1,见封二，表2)

头颅软组织侧貌形态学测量结果显示,实验组腭裂小鼠伴有明显的下颌体(BF)短缩;上颌突角(∠NAK)、下颌突角(∠NBD)均显示后缩畸形,实验组∠ABD均明显大于对照组(P<0.01),上下颌均表现出明显的发育障碍,而下颌后缩较上颌后缩更加明显。

2.3 H-E染色观察

孕期14.5d：实验组和对照组的胎鼠腭突均上抬至水平,对照组腭突进一步融合,并有上皮中缝形成,实验组腭突无进一步融合,腭突不再生长;孕期15.5d：对照组的嵴上皮细胞继续生长使上皮中缝消失,腭突完整。实验组的腭突体积过小,两腭突无法融合;孕期16.5d对照组腭部发育完好,实验组形成腭裂(图2，见封二)。

表2 胎鼠头颅软组织侧貌形态测量学结果Tab 2 The craniomaxillofacial soft tissue morphology of mouse embryos

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.4 BMP-2和TTF-2蛋白的表达

免疫组织化学检测显示BMP-2和TTF-2在腭裂胎鼠鼻中隔软骨中持续表达;孕期14.5～16.5d实验组鼻中隔软骨细胞中BMP-2阳性信号表达水平依次增强,且同时间实验组阳性低于对照组(P<0.05);对照组鼻中隔软骨TTF-2表达呈现波动性,孕期15.5d表达最高,而实验组在孕期16.5d仍持续增高,数值高于对照组(P<0.05)(图3，见封二,表3)。

表3 实验组与对照组BMP-2与TTF-2的表达(IA值)比较Tab 3 The IA values of BMP-2 and TTF-2 in experimental and control groups

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 讨论

目前腭裂畸形动物模型的制备方法有多种,因受实验条件与技术手段的制约,国内学者普遍选用C57BL/6J小鼠或昆明白小鼠作为致畸动物,而在选择致畸药物的种类、用量及给药时间等方面存在较多差异。陈沐等[6]选用C57BL/6J小鼠用全反式维甲酸梯度浓度灌胃的方式建立腭裂模型,结果显示100mg/kg为最佳诱导浓度。柴茂洲等[7]对孕期10d孕鼠连续3d 胃饲四氯苯对二恶英3μg/kg,联合腹腔注射地塞米松6mg/kg,腭裂的发生率可达100%。本课题组通过前期实验已证实,在孕期11.5d对昆明白小鼠腹腔注射地塞米松50mg/kg,同样可以有效建立腭裂模型[8]。

先天性的腭裂患者往往伴有颅面部骨骼的发育畸形,形成咬合关系的错乱以及造成颜面部的不美观。动物实验显示,胚胎在过量摄入维甲酸类药物可导致神经系统、循环系统及颜面部畸形,而上颌骨的发育障碍是腭裂畸形的表现之一[9-10]。Kai等[11]对人类与鼠类腭裂的口腔组织结构比较研究认为,腭裂标本鼻中隔的软骨以及鼻中隔的附属器官均表现出发育不足,组织内细胞的增生与分化伴随硬腭与软腭关闭的全程。结合本研究头颅软组织侧貌分析结果,显示地塞米松诱导后胎鼠上颌骨长度缩短,导致整个上颌骨体形状的整体改变,造成组织器官位置的变化,说明地塞米松诱导的腭裂模型,在抑制腭突融合产生腭裂畸形时,也会影响到颌面部的正常发育,这一点有别于继发性腭裂,更接近于临床上的原发性腭裂。

免疫组织化学显色结果显示,孕期15.5d时正常对照组鼻中隔软骨BMP-2呈高水平表达,实验组地塞米松作用后表达下调(BMP-2持续增高);正常对照组鼻中隔软骨TTF-2表达呈现波动性,孕期15.5d表达最高,而实验组在孕期16.5d仍持续增高,数值高于对照组。BMP属于是转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)超级家族的成员,参与胚胎发育中多种干细胞的分化活动,可诱导未分化间充质细胞向骨细胞及软骨细胞分化而BMP-2在膜内成骨和软骨内成骨中呈现高表达[12]。TTF-2属于叉头/螺旋翼结构域蛋白家族,通过特异性选择结合甲状腺球蛋白和甲状腺过氧化物酶基因的启动子来调控转录,其在胚胎发育中具有高度组织和时空特异性,是甲状腺、腭等器官发育的重要调节因子[13]。

胚胎时期若TTF-2持续表达往往表现为甲状腺发育不全或者腭裂,而正常小鼠的TTF-2表达并不持续是一个短暂的过程。在正常胎鼠腭突的发育过程中,当TTF-2表达降低或消失时,腭突将融合,腭裂也不会形成。Christian等[14]从基因角度表明TGFβ3和TTF-2的相互作用,也会对胎鼠腭部发育有重要的影响。两种基因的协调发展使腭突向正常的方向发展,并且发生融合形成正常的腭部,当两种基因的协调过程出现干扰就会导致腭突的发育畸形。而石冰等[15]通过建立地塞米松诱导腭裂模型,表明了地塞米松影响腭细胞表皮生长因子和TGFβ1的基因表达改变腭细胞的正常生长,从而形成腭裂。更有学者认为地塞米松可抑制间充质细胞的增殖分化,直接影响腭突中间缘上皮细胞的代谢过程,启动增殖和凋亡机制抑制胎鼠面部的发育导致腭裂等畸形的发生[16]。根据一些学者通过对腭裂发生机制的研究表明,腭裂的发生可追溯到胚胎细胞,通过影响胚胎细胞外基质影响腭细胞的生长,当致畸因子作用于此时期便会发生腭裂,并且可影响多种生长因子的基因表达而导致此结果[17-18]。

综上，地塞米松可有效诱导胎鼠腭裂及颅面部畸形的发生,该动物模型的建立是研究颅面部畸形的实用工具,并可为今后在胚胎学及分子生物学研究发病机制给予帮助。

图1 胎鼠在孕期14.5、15.5、16.5d对照组(A～C)与实验组(D～F)侧貌分析,标尺=2mm.

图2 胎鼠在孕期14.5、15.5、16.5d对照组(A～C)与实验组(D～F)H-E染色结果,标尺=200μm。S：鼻中隔；P：腭突.

图3 胎鼠在孕期16.5实验组鼻中隔免疫组织化学显色,标尺=50μm。A,B,C：BMP-2染色；D,E,F：TTF-2染色.

Fig 1 The craniomaxillofacial morphology of fetal mouse on gestation day 14.5、15.5、16.5 in the control group (A-C) and experimental group (D-F),bar=2mm.

Fig 2 H-E staining results in morphology change of fetal mouse on gestation day 14.5、15.5、16.5 in the control group (A-C) and experimental group (D-F).S：Septum nasi;P：Palatine process,bar=200μm.

Fig 3 lmmunohistochemistry results in nasal septum of the experimental group on gestation day 16.5,bar=50μm.A,B,C：BMP-2 staining;D,E,F：TTF-2 staining.