广东地区小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定分析

刘佳佳，苏晓娜，王占新，覃健萍，曾凡桂，田 野，鲁俊鹏

(1.广东温氏食品集团股份有限公司，广东 新兴 527439；2.广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东 新兴 527439)

鹅细小病毒病又称小鹅瘟，是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性传染病，造成肠栓塞、纤维素性肠炎及神经症状等，具有高发病率和死亡率,严重制约着水禽业的发展。

GPV基因组为单链线性DNA，5 106 bp。其基因组由左右两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)和两端的末端重复序列(Inverted terminal repeats, ITR)组成[1]。分析GenBank上各水禽细小病毒基因组序列发现，在两个ORF之间间隔18 bp，左侧ORF编码NS1和NS2两个非结构蛋白。右侧编码区编码结构蛋白，GPV共编码3个结构蛋白(VP1、VP2和VP3)，VP2和VP3是病毒的主要衣壳蛋白，GPV主要抗原决定簇分布在其中[2]。

本实验室近几年一直在对细小病毒进行流行监控，2016年广东地区一鹅场7日龄的雏鹅发病死亡率高达70%，剖检发现雏鹅的肠道有栓塞现象，胰腺有白点，肝脏肿大等疑似小鹅瘟的症状。实验室采集发病雏鹅的肠、肝脏、胰腺等进行了病毒的分离鉴定，确诊为小鹅瘟，并对其进行了全基因序列的测定分析，了解了广东地区流行GPV的基因特征，又为疫苗的选用及疾病的防治提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 广东地区某鹅场。

1.2 鸭胚 购自广东地区某孵化场。

1.3 试验动物 购自佛山某鸭场(母源抗体较低)。

1.4 质粒、菌株 克隆载体pMD18-T、Top10感受态细胞，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.5 试剂及耗材 胰蛋白胨、酵母提取物，购自 OXOID 公司；0.22 μm无菌滤器，购自Millipore 公司；琼脂糖，购自北京百奥康生物技术有限公司；Gold view I型核酸染色剂、DNA Marker DL-2 000、 DL-5 000，PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)、LATaq聚合酶、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)试剂盒,均购自TaKaRa公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、 AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit，购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM细胞培养液，购自GIBCO公司。

1.6 方法

1.6.1 病料的处理及病毒在鹅胚上复制 将采取疑似发病的鹅的肝脏、小肠等组织器官研磨，加入适量的双抗溶液，反复冻融3次，6 000 r/min离心10 min，4 ℃静置4 h，然后通过尿囊腔接种法接种12日龄鸭胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃孵化箱孵化，每天照鸭胚，弃去48 h内死亡的鸭胚。收集48 h后死亡的鸭胚尿囊液，同时观察胚体变化，并用此尿囊液在12日龄番鸭胚上盲传3代。收集尿囊液，于-80 ℃保存。

1.6.2 病毒在GEF细胞上的复制 首先按照2010年版兽药典制备鸡胚成纤维细胞SOP标准进行GEF细胞的制备，使每毫升约含1×106个细胞，将细胞铺到6孔板中，没孔2 mL，24 h生长至单层后，接种上述尿囊液，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h 后，用PBS洗3遍，加入含2%FBS DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养96 h，每天观察细胞病变，在出现80%细胞病变或96 h后，收集细胞及上清，于-80 ℃保存。

1.6.3 小鹅瘟特异性PCR检测 小鹅瘟特异性检测引物参照梦繁星发表文章，引物序列为F:5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′，R：5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′[3]，将收取的尿囊液和细胞液按照 AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书进行操作，参照 PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)试剂盒说明书进行PCR扩增。体系为PrimerTaq：10 μL，上游引物：1 μL，下游引物：0.1 μL，ddH20:6μL, 模板：2 μL。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增： 94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s/40 s，共进行30个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.6.4 病毒动物回归 将上述收集到的致死鹅胚的尿囊液，取0.2 mL 104.0EID50/0.2 mL的病毒量肌肉注射7日龄无母源抗体的番鸭。攻毒后逐日观察并记录小鸭的精神状态、饮食、饮水情况，发病和病死情况。

1.6.5 细小病毒总DNA的提取 按照 AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书进行操作。

1.6.6 全基因引物的设计与合成 引物设计参照在GenBank上载的GPV B 株、GPV 06-0329株和MDPV GX5株序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如表1 所示。

表1 全基因序列测序引物序列

1.6.7 PCR扩增 参照 PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)试剂盒说明书进行PCR扩增。体系为PrimerTaq：20 μL，上游引物：2 μL，下游引物：2 μL，ddH20:12 μL, 模板：4 μL。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增： 94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s/2 min，共进行32个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增ITR区和中间编码区过程中，72 ℃延伸的时间分别定为40 s和 2 min。用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的条带。

1.6.8 PCR 扩增产物的回收和纯化 使用 Axygen 凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收与纯化，按说明书操作进行。

1.6.9 PCR纯化产物与载体连接 连接反应参照TaKaRa公司pMD18-T Vector使用说明书进行。连接反应体系为pMD18-T Vector：1 μL，Solution I：5 μL，PCR产物：4 μL，混匀离心后，于16 ℃连接过夜。连接产物直接用于下一步转化试验。

1.6.10 连接产物转化感受态细胞 将感受态细胞从-80 ℃中取出，融化后取50 μL，加入上述的连接产物5 μL，轻轻混匀，冰上放置30 min；于42 ℃热休克90 s后迅速冰浴10 min；加入200 μL LB液体培养基，于37 ℃摇床中以160 r/min振摇培养60 min；将慢摇后菌液均匀涂布于已预热的LA固体培养基中，待菌液被平板吸收后，将平板放在37 ℃温箱中倒置培养12～16 h。

1.6.11 阳性菌落的筛选和鉴定 从上述平板中挑取5～10个单克隆菌落，分开接种于1 mL含LA液体培养基中，37 ℃，220 r/min振摇培养4 h。直接用上述菌液作为PCR模板进行菌液PCR鉴定，鉴定阳性的，每个基因片段选择3个经PCR检测为阳性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.6.12 序列拼接与分析 测序结果用DNAStar分析软件中的SeqMan进行拼接、整理，利用MegAlign进行序列的比对分析，利用MEGA 7.0进行进化树的构建。

2 结果

2.1 病毒的分离

2.1.1 病毒在鹅胚上的分离 鹅胚第一代在第6天左右出现死亡，取出胚体，可见胚体颈部四肢皮肤均有充血、出血，肝脏轻度出血。见中插彩版图1。

2.1.2 病毒在GEF上的分离 尿囊液接种DEF细胞，盲传3代，在第4天左右细胞出现变圆、皱缩，折光度增强，最后细胞脱落细胞间隙增大等细胞病变。见中插彩版图2。

2.1.3 PCR鉴定 PCR 扩增病毒基因，得到的条带与预期条带大小相似375 bp。

2.1.4 动物回归试验结果 第2天开始发病，第3天出现死亡；前期发病严重，第2周后症状开始减轻，到第3周病鸭基本恢复正常；病鸭出现断毛、精神沉郁、脚软喜卧；病死鸭剖检发现肝脏肿大、出血，胰腺发白出血，十二指肠糜烂，卵黄蒂附近肠段严重肠栓塞、肠出血。见中插彩版图3。

2.2 全基因序列的测定分析 应用序列分析软件DNAStar Lasergene 7.1中的SeqMan对测序结果进行拼接，各毒株基因组片段具体信息如下表2所示。

表2 毒株基因片段信息表

2.2.1 全基因序列同源性分析 分离株ZJF序列全长为5 046 bp，与江淮地区报道的鹅源LH株的基因全长相同，同源性也最高为98.6%;与广东早前分离株GDaGPV同源性为93.8%;与番鸭小鹅瘟SDHZ1604、JS1603株同源性为94.9%、95%;与番鸭细小病毒代表株MDPV-P1株及SAAS-SHNH株同源性最低为81.4%，86.1%。分离株ZJF ITR区全长与江淮地区LH株、SHFX1201株相同，为414 bp，相较于欧洲标准株Virulent B株、GDaGPV株在67-80(CACGTGTTTCCGGT)及333-347(AGCATGTGACCGGA)处有碱基缺失。ZJF株的结构基因VP1全长为2 199 bp，无任何核昔酸的缺失或插入，编码732个氨基酸。与江淮地区Yan-1株核苷酸、氨基酸同源性最高为99.7%(99.3%)。与江淮地区LH、SHFX1201株等分离株核苷酸、氨基酸同源性在97.3%～97.9%(98.2～99.3%)之间。与欧洲标准株Virulent B株核苷酸、氨基酸同源性为97.5%(98%)。与广东早前分离株GDaGPV株核苷酸、氨基酸同源性较低，分别为94.5%、94.7%(97.4%、97.8%)。与番鸭小鹅瘟SDHZ1604、JS1603株核苷酸、氨基酸同源性分别为95.2%、95.3%(97.3%、97.4%)。

2.2.2 VP1基因进化树分析 分离株ZJF属于GPV分支，在这个大分支中又分为不同的小分支，分离株ZJF株与安徽分离株Yan1属于同一小分支，江淮地区以LH、SHFX1201株为代表的分离株处于一个小分支，欧洲标准株Virulent B株处于一个小分支，GDaGPV、SYG61v株处于一个小分支中，番鸭小鹅瘟SDHZ1604、JS1603株处于同一小分支中。VP1进化树见图4。

图4VP1基因进化树

3 讨论

对华南地区一鹅场送检的病料进行常规处理后，通过鹅胚、鹅胚成纤维细胞进行病毒分离、PCR方法进行病毒鉴定分离到一株天然小鹅瘟毒株，命名为ZJF株。动物回归试验结果表明其为一株强毒。经过全基因序列的测定分析，分离株ZJF株序列全长为5 046 bp，与江淮地区报道的LH、SHFX1201等基因全长基本相同，同源性也最高为98.2%～98.6%，与广东地区早期GDaGPV分离株同源性较低为93.8%。分离株ZJF ITR区全长与江淮地区LH株、SHFX1201株相同，为414 bp，相较于欧洲标准株Virulent B株、GDaGPV有碱基的缺失，有报道称ITR的长短与病毒的毒力有关，短的毒力为强毒株，长的为弱毒株，与本研究ZJF分离株病毒为强毒株相符合[4]。

ZJF分离株VP1进化树分析显示，其与安徽分离株Yan1属于同一小分支，江淮地区以LH、SHFX1201株为代表的分离株处于一个小分支，欧洲标准株Virulent B株处于一个小分支，GDaGPV、SYG61v株处于一个小分支中，番鸭小鹅瘟SDHZ1604、JS1603株处于同一小分支中，提示小鹅瘟的VP1基因存在抗原的多样性。国内对于水禽GPV全基因测序研究相对较少，导致GPV病毒基因分型较混乱，所以对GPV病毒进行全基因序列的测定分析是十分有必要的。

ZJF分离株与广东1978年分离的GDaGPV的进化关系相对较远，有可能广东地区小鹅瘟毒株一直在持续的进化，也有可能与本地雏鹅苗不足，大量外购外地鹅苗，导致新的小鹅瘟毒株的传入。