抗菌肽对蜜蜂细菌性病原的抑菌作用研究

沈克飞 翟少欽 曹 兰 杨 柳 张邑帆

（重庆市畜牧科学院，荣昌 402460）

囊状幼虫病是中蜂的重要疾病，造成严重且典型的临床症状，威胁幼虫发育和蜂群群势，甚至导致蜂群飞逃。中蜂囊状幼虫病最早于1972年发生于广东省，随后迅速蔓延到全国和东南亚的中蜂饲养国家和地区。在1972年至1976年的该病流行期间，中国境内饲养中蜂损失超过百万群。后来疾病的损耗降低，但蜂群的发病率仍在50%～70%。

引发蜜蜂囊状幼虫病（Sacbrood）的病原是蜜蜂囊状幼虫病病毒（Sacbrood virus，SBV），感染中蜂的SBV常被称为中蜂囊状幼虫病病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）。SBV为正链单股RNA病毒，属于昆虫小RNA样病毒（Picorna-like virus），被划入传染性软化病病毒属（Ifl avirus）。该病毒基因组除去Poly A尾大约含有8830个碱基，只有1个大的开放阅读框架（Open Reading Frame），编码大约2860个氨基酸残基的多聚蛋白（Polyprotein）。在病毒自身编码的蛋白酶的作用下，多聚蛋白氨基端剪切、加工产生成熟的结构蛋白，羧基端剪切、加工产生为非结构蛋白。目前，对蜜蜂病毒性病原的研究主要集中在病原检测及系统进化分析，很少涉入病毒的分离培养。病毒的鸡胚培养法是应用于病毒病的诊断、预防和防治方面的有效手段，也是研究病毒生物学特性的途径之一。本实验开展了CSBV鸡胚培养方法的尝试，以期提供简便的CSBV体外培养方法。

1 材料与方法

1.1 样本

采自重庆地区暴发囊状幼虫病的中蜂场，具有典型囊状幼虫病特征，经RT-PCR法鉴定为SBV阳性[1]，于-80 ℃保存。

1.2 主要试剂

rTaq DNA聚合酶、pMD18-T载体、Trizol和PrimeScript RT-PCR Kit均购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司。CSBV部分结构蛋白抗血清由重庆市畜牧科学院兽医研究所制备并保存[2]。

1.3 病毒分离

病死中蜂幼虫及其渗出液与生理盐水按1：10比例加入，于研磨器中研磨5 min，5 000 r/min离心10 min，收集上清，加入终浓度1000 单位双抗，37 ℃孵育30 min后，经尿囊腔接种活力旺盛的9日龄鸡胚5枚，0.2 mL/枚，37 ℃培养。同时设正常鸡胚对照。无菌收集尿囊液，并盲传5代。

1.4 分子病毒学鉴定

1.4.1 引物设计

根据CSBV广州株基因组序列（GenBank登录号：AF469603）设计扩增CSBV-CQ编码序列的引物。引物由生工生物工（上海）有限公司合成。引物序列见表1。

1.4.2 总RNA的提取

表1 用于CSBV RT-PCR扩增的引物

取3 00 μL尿囊液加入7 00 μL Trizol混匀，室温静置15 min后，加入250 μl氯仿，充分振荡后室温静置15 min；加入250 μl氯仿充分振荡后静置15 min；4℃，12 000 r/mim离心15 min；取上清，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃静置1 h；4℃，12 000 r/min离心10 min。沉淀用70%的乙醇洗涤一次，吸干上清，沉淀溶解于100 μl经DEPC处理的去离子水中，以备反转录。

1.4.3 RT-PCR法病毒检测

使用PrimeScript RT-PCR Kit及其Random 6mers，以提取的尿囊液总RNA为模板反转录合成cDNA第一条链，实验操作按试剂盒说明书进行。以反转录合成的cDNA为模板PCR扩增CSBV-CQ编码序列。PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含15 mM Mg2+）2.5 μl，2.5 mM dNTPs 0.5 μl，5 U/μl rTaq 0.1 μl，10 μM的上、下游引物各0.5 μl，cDNA 0.5 μl，补去离子水至25 μl。反应条件为：94℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃再延伸5 min。所用引物见表1。

1.4.4 条带与序列分析

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带，将其克隆至pMD18-T载体，用质粒上的通用引物M13+/ M13-进行双向序列测定，将所得序列在NCBI上作BLAST搜索以进行同源性分析。

1.5 免疫印迹分析

CSBV感染致死幼虫样本和接种CSBV尿囊液分别经10% SDS-PAGE分离后转印NC膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h；TBST洗涤3次；加入CSBV抗血清（1：1000稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤3次；再加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG（1：5 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤3次；置BCTP/NBT显色液中显色。

2 结果

2.1 鸡胚接种

CSBV第一次接种9日龄鸡胚尿囊腔后，在前4天孵化期间鸡胚未死亡，发育速度正常，胚体无明显出血点，肝脏有出血点。正常对照胚体及肝脏无出血点。连续盲传5代，鸡胚无死亡，现象同第一次接种。

2.2 病毒RT-PCR鉴定结果

RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见使用CSBV特异的引物从接种鸡胚尿囊液提取的总RNA中扩增出清晰、特异、大小与预期相符的条带（图1），而未接种鸡胚未扩增出条带。5次盲传尿囊液均扩增出相同条带图谱。经序列测定及序列分析得出，所扩增片段是SBV基因片段，片段拼接后获得一条长度约占SBV基因组90%的片段，与CSBV-CQ分离株（GenBank登录号：KC285046）同源性（高于99.5%）高于其他分离株。

图1 RT-PCR扩增结果 M：DNA marker DL2000；1-9：分别为引物SB1F/SB1R-SB9F/SB9R的产物

2.3 免疫印迹分析

CSBV抗血清与CSBV 感染致死幼虫样本和CSBV接种鸡胚尿囊液强烈反应而产生一条特异条带，但接种鸡胚尿囊液CSBV滴度不及感染致死幼虫样本CSBV滴度，接种鸡胚尿囊液稀释2倍后特异条带亮度极弱；未接种鸡胚尿囊液无任何条带出现（图2）。

3 讨论

图2 免疫印迹结果

囊状幼虫病正困扰着中蜂产业的发展，其危害日益受重视。病原分离培养是进行病原学研究的基础。赖德真等于1982年报道了用鸡胚组织培养囊状幼虫病病毒[3]。本实验将囊状幼虫病致死的中蜂幼虫悬液接种9日龄鸡胚，盲传5代均可见鸡胚肝脏有出血点，用RT-PCR法从接种尿囊液中扩增出了CSBV的基因组片段，运用免疫印迹法检测到接种鸡胚尿囊液存在CSBV颗粒，表明CSBV在鸡胚尿囊腔中可增殖。但接种鸡胚尿囊液免疫印迹条带亮度不及病死幼虫样本条带亮度，显示尿囊液中的病毒滴度较低。目前，SBV的体外培养主要依靠不能传代的蜜蜂中肠细胞[4]，该细胞的培养需要极高的专业技能，而本实验为CSBV提供了简便的培养法，为进一步开展CSBV病原学和分子遗传学研究奠定了物质基础。

在自然感染中，SBV容易发生遗传变异，导致病毒的致病性、细胞嗜性、生物学特性等发生较大改变。依据系统进化分析可将感染西方蜜蜂和东方蜜蜂的SBV总体上分为欧洲基因型和亚洲基因型病毒，亚洲的西方蜜蜂蜂群中存在2个基因型病毒，而东方蜜蜂体中存在2个基因型基因片段[5-10]。研究指出，SBV具有型特异的遗传变异特性[10]，也同其它小RNA病毒一样基因型间存在基因重组，这给适应新的蜜蜂种类提供遗传学基础和条件。

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