两种野生动物蛔虫线粒体cox1基因序列差异性研究

邱启官，李 庆，许英蕾

(1.长沙生态动物园，湖南 长沙 410119 ; 2.浙江农林大学动物科技学院，浙江 杭州 311300)

我国是濒危野生动物大国，野生动物不仅是生态圈的一个重要部分，同时也是我们全人类的共同的宝贵财富。野生动物濒临灭绝大致可以分成两个因素，第一个因素是我们人类在大自然中的部分行为所引发的直接的或间接地结果；第二个因素是野生动物自己本身的基因遗传，疾病等问题造成的，在疾病对野生动物的危害中寄生虫危害是其中一个主要的病因。全国各地的野生动物保护机构、动物园等虽然为野生动物的生存提供了一定的保障,但将野生动物聚集在一个固定的区域里时,这将大大的增加寄生虫感染或交叉感染的机率。Stephen A.Smith 认为不论野生或圈养猛禽都可能从捕食疾病、受伤、或者被捕食等问题使得自身或上级食物链直接或间接感染了某种寄生虫致使自身或上级食物链动物出现寄生虫病害问题。这些研究均表明，野生动物及圈养野生动物的健康已受到寄生虫的严重威胁[1-3]。如何能够预防寄生虫对野生动物的侵袭，寻找一种有效的、准确的手段快速的检测出野生动物体内的寄生虫，以及对患有寄生虫的野生动物提供一种有效的治疗手段，这些问题都是当代迫切需要解决的问题。

蛔虫是寄生在动物胃肠内的一种大型寄生线虫，严重时往往引起动物肠梗阻死亡或者生长发育不良等现象。蛔虫繁殖力强，10～20万卵/天·虫，每虫一生可产3 000多万个卵，虫卵对外界各种因素的抵抗力强，易于发育成感染性虫卵。因此，环境是蛔虫普遍感染的重要因素。由于人类活动所造成的一系列环境、生态等问题使蛔虫反复感染率、人兽共患机率都有所升高，这对人类健康、野生动物保护造成了威胁[4-7]。

国内外对白狮寄生蛔虫研究得很少，猎豹是从非洲引进的动物，在本地饲养已有5年，由于蛔虫寄生宿主具有特异性，因此研究寄生于这2种野生动物的蛔虫，有利于寄生虫疾病的防治[8]。传统的寄生虫分类有很大局限性，随着分子生物学的兴起和PCR技术的成熟，蛔虫的研究可以准确分类至亚种[9]。而线粒体内细胞色素I(cox1)具有种内保守，种间差异大的特点，被广泛应用于寄生虫的准确分类研究中[10]。本次样本均采集自长沙生态动物园的白狮和猎豹，利用PCR技术，对样品蛔虫进行准确鉴定，并比较来自2种不同动物蛔虫的差异性。

Blouin认为，用线粒体DNA内的cox1 和nad4基因作为遗传标记来鉴定虫种，尤其是隐藏种更为有效。李明伟等应用PCR-SSCP技术和 DNA序列分析对犬弓首蛔虫(Toxocara canis )线粒体DNA (mtDNA) 中的细胞色素C氧化酶第1亚基(cox1 ) 基因部分序列(pcox1 ) 进行了分析研究，并与弓首属的猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫及弓蛔属的狮弓蛔虫进行了种间比较[11-12]。结果表明，不同犬弓首蛔虫地方株的cox1 基因序列有一定差异，显示较明显的多态性；同时，线粒体基因序列分析的结果与种特异PCR鉴定结果一致。

聚合酶链反应-单链构象多态性分析 (PCR-SSCP) 是20世纪90年代发展起来的一种用于检测DNA突变的分析方法，具有简便、快速、敏感、无假阳性、成本低等特点，适用于大量样本的筛选，是生物医学领域中最常用的基因突变检测方法之一[13-14]。本研究应用PCR-SSCP方法并结合DNA序列分析对弓首蛔虫线粒体DNA内的cox1 基因进行多态性研究，以进一步明确该属虫种的分类 。

1 材料与方法

1.1 寄生虫采集 本试验所用虫体样品均采自长沙生态动物园。其中包括白狮(编号：WL1、WL2)和猎豹(编号：CH1、CH2)两种动物蛔虫成虫 4个样本，经形态学初步鉴定为蛔虫，70%酒精保存。

1.2 主要试剂 DNA分子量标准 DL-2000、TaqDNA 聚合酶，购自宝工生物工程(大连)有限公司；蛋白酶 K由天根生物科技(北京)有限公司生产；Wizard DNA Clean-up System为Promega公司产品。

1.3 引物 根据弓首蛔虫线粒体内细胞色素I(cox1 )基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列为上游引物(JB3) : 5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24 bp)，下游引物(JB4.5): 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′(24 bp)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 DNA提取 从70%酒精中用无菌镊子取出单个虫体，用双蒸水反复吹洗6次，每次5 min。用灭菌微型剪刀剪取虫体2 cm大小片段样品至于1.5 mL的离心管内剪碎，加入200 μL GA Buffer 溶液与30 μL蛋白酶K 溶液，反复震荡混匀后，置于65 ℃恒温箱内消化2-3 h，每30 mins 混匀1次。消化完全后的虫体悬浊液按照DNA 提取试剂盒使用说明书提取DNA，DNA 样品分装后置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.5Pcox1 基因片段的PCR 扩增与鉴定 PCR扩增体系为25 μL： 双蒸水13.25 μL、MgCl(25 mmol/L)4 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、上、下游引物(50 pmol)各0.5 μL、rTaq(5 U/μl)0.25 mL、模板DNA 2 μL，混匀后短暂离心15 s。同时，以双蒸水代替模版DNA 作空白对照。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循环37次，最后72 ℃延伸5 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并将PCR 阳性产物进行纯化后送至华大基因生物工程技术服务有限公司测序。

2 结果分析

2.1 PCR扩增结果 2种野生动物蛔虫成虫4个样品均扩增出约415 bp左右的条带，片段大小也与所扩的片段一致，空白对照也为阴性。详见图1。

2.2 序列分析 两种野生动物4个样品测序得到的Pcox1序列，与GenBankTM收录JF780951.1(狮弓蛔虫)序列用Blast软件比较，WL1与 JF780951.1比较3处碱基置换，1处碱基颠换序列差异1.0%；WL2与JF780951.1比较无序列差异，序列差异为0；CH1与 JF780951.1比较2处碱基置换，1处碱基缺失，序列差异1.0%；CH2与JF780951.1比较2处碱基置换，2处碱基缺失，序列差异 1.0%。

图1 弓首蛔虫pcox1 序列PCR扩增结果

2.2.1pcox1 基因序列系统进化分析 利用 DNAStar 5.0的MegAlign软件构建系统进化树显示，在长沙生态动物园分离到的2种野生动物蛔虫4个样品中，猎豹蛔虫(CH1、CH2)位于独立分支上，白狮蛔虫(WL1、WL2)与猎豹蛔虫(CH1、CH2)位于同一分支上，四个样品处在同一个独立分支上；猎豹蛔虫(CH1、CH2)和白狮蛔虫(WL1、WL2)与 GenBank 登录号 JF780951.1(狮弓蛔虫)位于同一大分支上；猎豹蛔虫、白狮蛔虫、JF780951.1(狮弓蛔虫)与 GenBank 登录号 AB446546.1：狸猫弓首蛔虫；JF780942.1：猫弓首蛔虫；JF780951.1：狮弓蛔虫；KC293913.1：犬弓首蛔虫；KC998824.1：猪蛔虫位于不同的大分支上。

图2 蛔虫Pcox1序列系统进化树

AB446546.1：狸猫弓蛔虫； JF780942.1：猫弓首蛔虫； JF780951.1：狮弓蛔虫； KC293913.1：犬弓蛔虫； KC998824.1：猪蛔虫

2.2.2pcox1基因序列同源性分析 利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 软件同源性分析显示，白狮蛔虫(WL1、WL2)序列差异达 4.2%；猎豹蛔虫(CH1、CH2)序列差异 0.7%；猎豹蛔虫(CH1、CH2)与白狮蛔虫(WL1、WL2)序列平均差异 3.6757%，且与 GenBankTM收录登录号 JF780951.1(狮弓蛔虫)比较：白狮蛔虫(WL1、WL2)序列平均差异4.05%，猎豹蛔虫(CH1、CH2)序列平均差异 2.5%；与 GenBankTM登录号 AB446546.1：狸猫弓蛔虫；JF780942.1：猫弓首蛔虫；KC293913.1：犬弓手蛔虫；KC998824.1：猪蛔虫序列相比差异均超过10.1%以上。

图3 线粒体DNA pcox1 基因片段的相似性和差异性(%)

注：Line1-9: CH2，CH1，WL2，WL1，AB446546.1(狸猫弓蛔虫), JF780942.1(猫弓首蛔虫), JF780951.1(狮弓蛔虫), KC293913.1(犬弓手蛔虫), KC998824.1(猪蛔虫)

3 讨论

本研究对湖南省长沙生态动物园2种野生动物4个蛔虫样品的Pcox1 基因序列进行遗传多态性分析发现，与 GenBank 收录 JF780951.1(狮弓蛔虫)序列用 Blast 软件比较，主要极少数的碱基置换、颠换、缺失及无差异，白狮蛔虫WL1、WL2 与 JF780951.1 基因序列差异 0～1.0%；猎豹蛔虫 CH1、CH2 与JF780951.1 基因序列差异 1.0%；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 软件构建系统进化树显示，白狮蛔虫 WL1、WL2 和猎豹蛔虫 CH1、CH2 位于同一分枝上，并与JF780951.1(狮弓蛔虫)最近，与其他序列相差较远；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign软件差异性比较，GenBankTM收录登录号 JF780951.1(狮弓蛔虫)与白狮蛔虫(WL1、WL2)基因序列平均差异 4.05%，与猎豹蛔虫(CH1、CH2)基因序列平均差异为 2.5%，与其他序列相比差异均在 10.1%以上。因此，这来自于两种动物的4个蛔虫样品均为狮弓蛔虫。

线粒体DNA (mtDNA)基因组缺乏细胞核基因组中的保护机制，变异较为明显，能够反映较短时间内的进化事件，被广泛应用于物种及种下关系的鉴别[15]。 本研究结果揭示mtDNA 中的Pcox1 序列可作为遗传标记鉴定蛔虫虫种，对今后野生动物寄生虫病的虫种分子鉴定、群体遗传、系统进化研究和流行病学调查具有一定的指导意义。