大鲵脾脏结节病的防治试验

王 强，程 洁，梁 毅，罗 强，王朝明，黄 利，吴 青

(1.重庆市壁山区养殖业技术服务中心，重庆 壁山 402760；2.西南大学动物科学学院，重庆 荣昌 402460)

大鲵，俗名“娃娃鱼”，是世界上现存最大的两栖动物，属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科。是国家二级保护动物，是国家特色农业重点开发生态养殖品种。具有可食用、 药用 、观赏 、科研等经济价值。近年来，随着水产养殖业的兴起与发展，大鲵的人工养殖已成为具有重要的经济价值的产业，但是，各种养殖病害问题也随之而来，成为制约大鲵养殖业的发展的重要原因之一,给养殖户造成了巨大的经济损失。

中药是指在中国物性理论 (阴阳五行学说)指导下用于防治人和动物疾病、促进健康、 提高生产性能和动物产品质量的天然物质，我国拥有丰富的中药资源，在渔业生产实践使用上，中药有着悠久的使用历史。研究显示，中药有着多方面的免疫活性物质，能影响和调节动物体免疫功能，提高水产动物的抗病力[1]，减少鱼体感染疾病的几率。使用中药于水产养殖防治鱼病不仅解决了化学药物的残留和产生抗药性等问题，而且对于发展绿色养殖，生产绿色无公害水产品，提高养殖生产效益等方面有着显著的效果。

2008年4月，重庆开县的某个大鲵养殖场出现了体表出现大量血点及出血现象，在身体腹部，两侧和尾部较明显，身体体表分泌大量白色黏液，病程较长的伴有四肢端部溃烂，大鲵不吃食。剖检观察其脾脏出现大量白色结节，并常伴有瘀血斑和坏死病灶，有的胃、肠道胀气，肠壁充血溃烂，有的伴有红色或乳白色的腹水，有的心脏瘀血肝脏有的出现瘀血、变性和坏死，有的肺出现发黑变性病灶，有的直肠末端出现发黑变性病灶(见中插彩版图1)。其后在四川一些养殖场也陆续出现此病。目前尚无文献报道。查阅了有关的文献，根据其作用机理，筛选了几种中药，通过采取中西结合的防治措施，大鲵的体质有所增强，病情得到了有效的控制。

1 材料与方法

1.1 材料 中药配方：大青叶，连翘，穿心莲，黄芪，大黄，黄连，杜仲粉，金银花，脯骨脂，党参，板蓝根。

试验试剂：姬姆萨染液 酸性磷酸酶测定试剂盒，一氧化氮和酶测定试剂盒，氯化钠溶液，枸橼酸钠溶液。

试剂配制：红细胞稀释液：氯化钠0.6 g，加蒸馏水100 mL溶解，4 ℃保存至锥形瓶中备用。

白细胞稀释液：枸橼酸钠3 g，加中性甲醛 1 mL，蒸馏水定容至100 mL，4 ℃保存至锥形瓶中备用。

1%肝素钠：肝素钠1 g，加0.6%生理盐水100 mL，漩涡震荡使之溶解，4 ℃保存至锥形瓶中备用。

实验设备：冰箱 恒温水浴锅，小型离心机，显微镜，分光光度计，全自动生化分析仪。

1.2 试验方法 试验前对所有试验池、工具，用高锰酸钾进行消毒处理。根据养殖条件，选择4个养殖池，以每2个池分为1组，2组，然后进行编号，其中1号为对照组，其余为试验组，对随机选取患病大鲵80尾，计量体重，随机分配至4个养殖池中，记录娃娃鱼患病特征，饲养环境保持一致。根据该养殖场的养殖管理习惯以及大鲵的摄食习惯，试验组的大鲵取用熬制好的浓缩中药汤剂对患病大鲵进行灌服操作，每日用量(0.8 mL/kg·bw),1次/d；本试验采用自身对照，故不设对照组。灌药后对病鲵的恢复情况进行记录，每15天拍照1次，选出有代表性的进行比较。

1个疗程后，两人配合进行，随机对每个鱼池挑选1条进行采血，采取的血液放入加了肝素钠的EP管中4 ℃保存。

将放置在冰箱中保存的EP管取出，静置1 min，然后在3 000 r/min离心10 min，取上层液使用，剩余液体放入冰箱保存备用。按试剂盒说明书进行白细胞计数、血清中的酸性磷酸酶(ACP)以及一氧化氮合酶(NOS)的测定、谷丙转氨酶(ALT)的测定。

1. 3 数据处理 试验数据采用统计学中的ANOVA软件进行方差分析和均值多重比较法处理，数据用平均值±标准差表示，显著性水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01。

2 结果

2.1 灌药前后大鲵的恢复情况对比 灌药前，大鲵体表背部出现溃烂，四肢、尾部发生肿大、溃烂甚至出现穿孔现象，灌药后大鲵背部、四肢及尾部的溃烂面逐渐缩小，患病大鲵体表不再出现红肿、溃烂等情况，身体腹部及背部的溃烂情况有明显的好转，但是有极个别的恢复情况不是太明显，综合死亡的个数逐渐降低，病情得到了相对有效的控制，治愈率达到82.8%。

2. 2 患病大鲵灌药前后的血液生理指标的比较分析

2. 2.1 血细胞计数 通过显微观察大鲵血涂片，对血液细胞进行计数，其结果见表1 。由方差分析得出，与灌药后比较，患病大鲵灌药前的白细胞数目显著性高于灌药后(P<0.05),红细胞数目差异不显著(P>0.05)。

表1 患病大鲵灌服中药前后血细胞数量变化(平均值±标准差)

2.2.2 白细胞分类计数 通过对血涂片的观察，白细胞的分类比例如表2所示。方差分析表明，相比较灌药前，患病大鲵的嗜中性粒细胞比例显著下降(P<0.05)，淋巴细胞比例显著上升(P<0.05)，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞变化比例不显著(P>0.05)

表2 患病大鲵灌服中药前后白细胞分类比例变化(平均值±标准差)

2.2.3 患病大鲵灌药前后生化指标的比较 通过开县博爱医院对大鲵血清的谷草转氨酶(AST)，谷丙转氨酶(ALT)检验报告单进行分析，结果如表3所示。由方差分析显示，相对于灌药前，患病大鲵在灌药后血清指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著性下降(P<0.05)。

通过用一氧化氮合酶(NOS),酸性磷酸酶(ACP)试剂盒对患病大鲵血清酶的检测，所得结果如下表。相比较灌药前，灌药后患病大鲵的一氧化氮合酶及酸性磷酸酶活性显著下降(P<0.05)。

表3 患病大鲵灌服中药前后生化指标变化(平均值±标准差)

3 讨论

3.1 结节病致病菌对于大鲵的各项生理指标的影响 红细胞是血液中最多的一类血细胞，主要功能是运输氧气和代谢二氧化碳，使机体生命活动正常。鱼类的红细胞数在一定程度上能反映鱼体的健康状况[2]。目前，关于水生动物患病后的血液红细胞数目变化的研究，数据各有不同。患病综合征的石斑鱼的血液红细胞数相对于正常鱼高23.79%[3]。感染嗜水汽单胞菌的香鱼血液红细胞数目显著降低[4]。本试验中，中药灌服患病大鲵前后，血液红细胞数目变化不显著(P>0.05)，表明结节病致病菌对大鲵的红细胞数目变化差异不显著(P>0.05)。

白细胞具有免疫防御功能，它通过吞噬细胞吞噬有害物质以及淋巴细胞产生抗体来免疫调节机体。一般来说，鱼在发病后，其血液中的白细胞数目会上升。患肌肉溃烂病的中华倒刺鲃[5]的白细胞数目显著性上升，当疾病较为严重时，鱼体的造血功能和免疫功能损伤严重，则变为白细胞数目下降。患溶藻弧菌的鲈鱼[6]病发后期，白细胞数目下降。本试验中，大鲵患脾脏结节病后，血液生理生化指标表现为嗜中性粒细胞比例显著性上升(P<0.05)，表明大鲵的细胞吞噬能力较强，淋巴细胞比例显著性下降(P<0.05)，机体免疫能力较弱，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞比例变化不大。

正常情况下血液中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性低且较为稳定。当机体患病导致肝脏细胞受损时[7]，该类酶被释放到血清中，导致这两种酶的活性在组织中降低而在血液中升高。患溶藻弧菌病的花鲈[6]血清中AST、ALT的含量上升，认为是肝脏组织受损，致使血液中血清酶的含量上升。本试验中，大鲵患结节病后血清中ALT、AST含量显著上升，表明大鲵在结节病致病菌的作用下，肝脏组织受到损伤。

酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合酶(NOS)是存在于血液中参与非特异性的免疫相关酶[2]，在机体的免疫防御过程中起了十分重要的作用。研究表明，一氧化氮参与机体的免疫，能够杀灭细菌和病毒。大鲵在患病后血液中一氧化氮合酶的活性显著性升高。酸性磷酸酶(ACP)能促进病原物质在溶酶体内的消化降解。日本鳗鲡感染嗜水气单胞菌后，通过提高血清中ACP活力达到快速杀菌的目的。本试验中，大鲵患结节病后，ACP的活性升高。

3.2 中药对于患结节病的大鲵的影响 比较灌药前后的大鲵的血液生理生化指标。相对于灌药前，灌药后的病鲵的血清中嗜中性粒细胞比例显著性下降，淋巴细胞比例显著性的上升，表明大鲵在灌药后，以嗜中性粒细胞为主要非特异性免疫防御功能减弱。以淋巴细胞为主的免疫功能逐渐恢复。此外，患病大鲵血液中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性相对于灌药前，显著性下降(P<0.05)，表明肝脏的受损程度在灌药后逐渐减小，其功能得到了恢复。另外，灌药后，患病大鲵的NOS、ACP活性显著性下降，表明以吞噬细胞为 主的非特异性免疫应答激活程度逐渐降低，大鲵鱼体免疫能力有所提高，大鲵病情得到了有效控制。表明本研究所筛选的几种中药在一定程度上对大鲵的病情有一定的抑制作用。