魔芋白绢病病原菌生物学特性及中药提取物药物筛选

李利军,卢美欢，马英辉，郭邦利，郑建芳，张百忍，王小海

(1.陕西省微生物研究所，西安 710043；2.安康市农业科学研究所，陕西安康 725021；3.西安工程大学 环境与化学工程学院，西安 710048；4.北京瑞芬生物科技股份有限公司，北京 100192)

魔芋又名鬼芋、蒟蒻等，具有重要的药用、保健功能及观赏价值。魔芋块茎富含葡甘聚糖 (KGM)，可广泛用于食品、医疗、化工、造纸、纺织、石油等行业，被称为“东方魔粉”[1]。中国是魔芋生产大国，占世界总产量60%，魔芋精粉年产量约为1.5万t。其中，陕南秦巴山区的魔芋适生区面积约占全国魔芋适生区总面积的1/3，特别是以汉中、安康为代表，已成为区域特色经济的主导产业[2]。

随着陕南魔芋种植面积的逐年增加，白绢病发病率亦不断增加，成为继软腐病后的第二大病害。由于白绢病菌核抗逆性强，能在土壤中存活多年，在连续发病的田块，菌核数量不断增加，发病风险也随之不断上升。白绢病病原菌通过分泌细胞壁降解酶使魔芋发病，一般7月上旬开始发病，8、9月达到高峰期。目前常用化学药剂进行防治，据报道，丙环唑、烯唑醇对鸢尾白绢病有很好的抑制效果[3]，16%井冈·噻呋SC、苯甲·嘧菌酯对铁皮石斛白绢病菌丝生长抑制率达100%[4-5]。在生防菌剂防治方面，有研究表明解淀粉芽孢杆菌对花生白绢病有较好防效[6]，绿色木霉分泌的几丁质酶对白绢病有一定的防治效果[7]。化学药剂和生防菌剂复配对茉莉白绢病也有较好的防治作用[8]。利用中药提取物进行白绢病防治尚未见相关报道。为此，本研究在对陕南魔芋白绢病的病原菌进行分离鉴定、并研究其生物学特性的基础上，探究不同中药提取物对白绢病病原菌的抑制性能，为白绢病的新药筛选和绿色防控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

魔芋白绢病发病组织采自安康市农科所魔芋种植基地、汉中勉县魔芋种植基地，共收集到发病植株12份。发病魔芋均表现为茎部褐变腐烂，布满白色菌丝或白色至深棕色菌核。

厚朴酚(90%)、和厚朴酚(90%)、胡椒碱(95%)、蛇床子(35%)由北京瑞芬生物科技股份有限公司提供。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g,琼脂18 g,水1 000 mL，自然pH。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 病原菌分离

将白绢病魔芋发病组织表面冲洗干净，用无菌滤纸吸干多余水分，将发病组织切成直径约1 cm 的小块，置于无菌湿滤纸上30 ℃下恒温培养，待菌丝长出后，挑取菌丝转接于PDA平板。采用菌丝尖端切割法进行菌株分离纯化，获得单菌落。

1.4 致病性试验

采用盆栽魔芋植株测定白绢病病原菌的致病性。健康魔芋叶柄基部接种部位用灭菌针穿刺5 个小孔。在纯培养4 d 后的菌落边缘打孔取直径为10 mm 的菌饼，接种到叶柄的小孔上，盖湿润棉球保湿。设置3个重复。对照用湿润棉球直接覆盖于叶柄小孔上，喷无菌水保湿。在25 ℃条件下培养，如接种部位褐化、腐烂，并出现白色绢状菌丝，表现为典型白绢病症状，则对病部重新进行病原菌分离培养。

1.5 ITS DNA 的扩增、序列测定和比对分析

采用检测通用引物ITS1/ITS4。ITS1：5′ -TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3′，ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。

PCR反应体系：10×Buffer 2 μL，Template 1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，TransStartTaqPolymerase 0.2 μL，加ddH2O至20 μL。

PCR循环参数： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共9个循环；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共34个循环；72 ℃修复延伸5 min。

PCR胶回收，连接入pGM-T载体中并转化至宿主菌DH5α，涂布于LB/Amp+/X-Gal/IPTG平板上进行蓝白筛，挑选白色克隆做菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳验证菌落PCR，挑取阳性克隆培养，送交上海生工生物工程公司测序。ITS rDNA 序列在BLAST上比对。

1.6 不同温度对白绢病菌丝生长、菌核萌发的影响

将白绢病病原菌接种在PDA培养基中28 ℃培养5 d，用打孔器取直径为6 mm的菌饼，接种至PDA培养基，分别在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃恒温培养。设3个重复，每隔12 h用十字交叉法测定菌落直径。

将白绢病病原菌接种在PDA培养基中28 ℃培养10 d至菌核形成，取菌核放置于PDA培养基中央，每皿一个菌核，分别在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃恒温培养。设3个重复，每隔12 h用十字交叉法测定菌落直径。

1.7 不同pH对白绢病菌丝、菌核生长的影响

以PDA培养基为基础，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液将pH调整至4、5、6、7、8、9、10，接种方法和测量方法同“1.7”。

1.8 不同中药提取物对白绢病菌丝、菌核生长的抑制作用[9]

将不同中药提取物用无菌水配成50 mg/mL母液，经0.22 μm滤膜过滤，PDA培养基加热融化，冷却至50 ℃后混合药物，配成终质量浓度为5 mg/mL带药培养基，倒平板，接种白绢病菌饼或菌核，28 ℃恒温培养，采用菌丝生长速率法，定时用十字交叉法测量菌落直径。每个处理3个重复，同时做空白对照。

菌落净直径=菌落直径-菌饼直径

抑制率=(1-试验组菌落净直径/对照组菌落净直径)×100%

1.9 中药提取物最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定[10]

设置不同浓度的加药培养基，将菌饼接种至培养基28 ℃培养，12 h无菌丝生长的浓度即为MIC值，72 h无菌丝生长的浓度即为MBC值。

2 结果与分析

2.1 魔芋白绢病病原菌的分离及鉴定

从发病魔芋地块收集白绢病发病组织，进行病原菌分离，共获得6株纯菌。挑取菌丝分别接种在魔芋块茎和魔芋植株上，进行致病性检测，结果显示，其中4株菌均能使魔芋产生白绢病症状。菌株BJ1致病力最强，接种在魔芋块茎后，2 d即开始腐烂，后期整个块茎长满白色菌丝。接种在植株上，魔芋表现出典型的白绢病症状，先是茎部腐烂，然后在接种部位陆续长出白色丝状菌丝，进而长满白色至黄褐色菌核(图1)。从发病的组织和植株中又分离得到病原菌，证实该菌为魔芋白绢病病原菌。

2.2 病原菌菌种鉴定

2.2.1 菌落形态 PDA培养基培养，菌丝白色绢丝状，呈发散性生长，生长速度较快，48 h即能长满培养皿，5～7 d开始菌丝扭结成菌核，菌核逐渐由白色变成深褐色坚硬外壳(图2)，参考常用有关真菌的分类鉴定资料，与半知菌亚门真菌齐整小核菌形态相似[11-12]。

图1 魔芋感染白绢病症状Fig.1 Symptoms of Amorphophallus konjac infected with southern blight pathogen

图2 气生菌丝(左)、菌核形成过程(中)和菌核(右)Fig.2 White mycelia(left),sclerotinia formation process(middle) and brown sclerotia ( right)

2.2.2 ITS rDNA鉴定 提取菌株基因组DNA，进行ITS rDNA PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证，共获得686 bp(图 3)。PCR产物回收连接、转化，挑取阳性克隆培养，送交上海生工生物工程公司测序。每个产物用ABI3730XL测序仪测两个反应，再对结果进行拼接。测得ITS rDNA序列，在BLAST上进行序列比对，菌株鉴定为Atheliarolfsii(半知菌亚门真菌齐整小核菌)，相似度为99%。

2.3 病原菌生长特性

2.3.1 生长的温度范围 将病原菌BJ1的菌核和菌丝分别在4 ℃、10 ℃、15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃温度下进行培养，测定菌落直径。结果表明，菌丝与菌核在10～40 ℃都可生长，最适生长温度和萌发温度均为30 ℃，菌丝在15～37 ℃生长速率无明显差异(表1)。菌核在25～37 ℃能快速萌发并生长(表2)，较低温度(10 ℃以下)和较高温度(37 ℃以上)均能抑制菌丝萌发。

2.3.2 生长的pH范围 白绢病病原菌分别在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9和pH10条件下进行培养。结果表明，白绢病菌丝和菌核在pH为4～10时均能生长，酸性或碱性环境对菌丝生长无明显影响，菌丝最适生长pH为7(表3)，菌核在pH 6～8生长较好，最适萌发和生长pH均为8，pH小于5或大于8时抑制菌核生长(表4)。

图3 病原菌DNA PCR产物电泳图Fig.3 Patterns of soft rot bacteria DNA

2.4 魔芋白绢病中药提取药物的筛选

通过用药组和对照组比较，4种中药提取物对魔芋白绢病病原菌均有抑制作用。中药提取物在PDA培养基中质量浓度均为5mg/mL时，对白绢病菌菌丝的抑制试验显示(表5)，厚朴酚、和厚朴酚的效果最好，均能完全抑制白绢病菌丝的生长，各个阶段抑制率为100%。蛇床子抑制效果次之，在菌丝萌发的初始阶段抑制效果较好，随着时间增长抑制率降低，72 h时抑制率为59.24%。胡椒碱也有一定的抑制作用。对菌核萌发的抑制试验显示(表6)，4种中药提取物均不能完全抑制菌核萌发，但对菌核萌发后的菌丝生长有很好的抑制作用，厚朴酚、和厚朴酚、蛇床子的抑制率分别为74.73%、83.74%和88.14%。可见，中药提取物对菌丝生长有很好的抑制作用，但较难透过菌核坚硬的外壳屏障，抑制其萌发。菌丝受药物影响，变得膨大粗壮，分支增多，菌丝弯曲并扭结成团(图4和图5)，推测其抑菌机制可能是破坏细胞壁，使菌丝畸形，并阻碍菌丝的细胞壁、细胞膜形成。根据以上结果，进一步对抑制效果较好的厚朴酚、和厚朴酚进行毒力测定，厚朴酚抑制白绢病菌菌丝生长的MIC为30 μg/mL，MBC为50 μg/mL。和厚朴酚抑制白绢病菌菌丝生长的MIC为20 μg/mL，MBC为40 μg/mL。

表1 病原菌BJ1菌丝在不同温度的生长情况(72 h菌落直径)Table 1 Effects of temperatures on growth of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1(72 h colony diameter)

注：数据以“平均数±标准差”表示，大小写字母经 Duncan 氏新复极差法检验在0.01、0.05水平差异显著。下表同。

Note: Data in the table indicate “mean±SE”.Different uppercase or lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.01 orP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.The same below.

表2 病原菌BJ1菌核在不同温度的萌发情况(菌落直径)Table 2 Effects of temperatures on sclerotia germination of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1

注：数据为菌落直径，单位为mm。表4同。

Note:Data was colony diameter，unit was mm.The same as table 4.

表3 病原菌BJ1菌丝在不同pH的生长情况(72 h菌落直径)Table 3 Effects of pH on growth of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1(72 h colony diameter)

表4 病原菌BJ1菌核在不同pH的萌发情况Table 4 Effects of pH on sclerotia germination of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1

表5 不同中药提取物对魔芋白绢病病原菌菌丝在不同生长阶段的抑制Table 5 Inhibition of different Chinese medicine extracts on mycelium of Amorphophallus konjac southern blight pathogen at different growth stages

表6 不同中药提取物对魔芋白绢病病原菌菌核在不同生长阶段的抑制Table 6 Inhibition of different Chinese medicine extracts on brown sclerotia of Amorphophallus konjac southern blight pathogen at different growth stages

CK.对照 Control;1.厚朴酚 Magnolol;2.和厚朴酚 Honokiol;3.胡椒碱 Piperine;4.蛇床子 Cnidium;A.对菌丝的抑制 Inhibition on mycelium；B.对菌核的抑制 Inhibition on brown sclerotia

图5 厚朴酚对白绢病病原菌菌丝形态的影响(超景深三位显微镜观察，左：对照组；右：处理组) Fig.5 Effect of magnolol on mycelial morphology of Amorphophallus konjac southern blight pathogen (observed by super depth of field three microscope,left: control group; right: treatment group)

3 讨论与结论

白绢病又称菌核性根腐病和菌核性苗枯病，1891年，美国弗罗里达州首次报道番茄白绢病[13]。白绢病病原菌寄主范围很广，已报道的寄主包括100 多科中的 200 多种植物，是一种危害性很强的土传性病害[14]。本研究对分离得到的魔芋白绢病病原菌进行形态学和ITS序列分析，鉴定为Atheliarolfsii(半知菌亚门真菌齐整小核菌，无性世代为齐整小核菌Sclerotiumrolfsii)，与徐炜[15]、马琼等[16]研究结果一致。王雅等[17]报道芝麻白绢病病原菌适宜生长温度为22～34 ℃，最适生长温度为31 ℃；在pH为4.0～9.0时均可生长，最适pH为6.5～7.0。茹水江等[18]认为白术白绢病菌菌丝生长、菌核产生和萌发的最适温度均为30 ℃，菌丝在pH为4.0～6.0时生长最快，菌核萌发最适pH为5～7。本研究结果表明，魔芋白绢病菌丝与菌核在10～40 ℃都能生长，最适生长温度和萌发温度均为30 ℃，菌丝和菌核生长的pH为4～10，酸性或碱性环境对菌丝生长无明显影响，菌丝最适生长pH为7，菌核最适萌发和生长pH均为8。根据气象数据显示，魔芋适生区陕南年平均气温15 ℃左右，全年大部分时间白绢病菌丝都能快速萌发并生长，安康、汉中两地平均pH为6.5～7.0[19-20]，也十分利于白绢病病原菌的生长，可见白绢病的防治困难较大。

中草药源农药是一种毒性较低、对生态环境友好的农药，中国拥有100多种具有杀虫和抗菌活性成分的中草药资源[21]。本研究通过对比几种中药提取物对魔芋白绢病病原菌的抑制效果，发现厚朴酚与和厚朴酚有很好的抑制效果。厚朴是具有广泛药效功能的中药，厚朴酚与和厚朴酚是厚朴的两种主要活性成分，具有消炎抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理作用，在中医中药领域具有广泛用途[22]。在植物病害防治方面也有少量报道，厚朴酚与和厚朴酚对水稻稻枯菌具有很好的抑制效果，半数有效浓度(EC50)为4.15～12.69 mg/kg[23]。和厚朴酚对水果采后致腐青霉菌和链格孢菌有较好的抑制作用[24]。本研究测得厚朴酚与和厚朴酚抑制白绢病病原菌的MIC分别为30 μg/mL和20 μg/mL，MBC分别为50 μg/mL和40 μg/mL。利用厚朴酚与和厚朴酚等中药提取物，开发高效的植物源杀菌剂进行魔芋白绢病防治，有望改变白绢病难以防治的现状，同时满足环保低毒的要求，具有广阔的市场前景。