楸子 S6PDH基因启动子活性鉴定

夏 惠，梁 东，刘 继

(1.四川农业大学 果蔬研究所，成都 611130；2.成都市农林科学院，成都 611130)

山梨醇是一种小分子物质，不仅是大多数蔷薇科果树主要的光合产物[1]，也是碳水化合物的主要运输形式[2]，而且山梨醇可以在植物遭遇脱水[3]、低温[4]、缺素[5]和病害[6]等胁迫时在细胞内大量积累，通过调节细胞渗透势而改善植物抗逆性。多项研究表明，6-磷酸山梨醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase， S6PDH；EC 1.1.1.200)是山梨醇生物合成的关键酶[7-8]，催化葡萄糖-6-磷酸生成山梨醇-6-磷酸，随后在非专一的磷酸酯酶作用下生成山梨醇[9]。目前已在多种蔷薇科植物中获得了 S6PDH基因序列[10-13]，研究发现它的表达在光合组织[14-16]或逆境条件下[17-19]较高。多个转基因的研究也证明了 S6PDH基因在植物抵御逆境胁迫方面的功能[20-22]。

真核生物中基因的表达调控是一个复杂的问题，而转录作为基因表达的初始步骤，是基因表达调控机制中重要的一环，启动子在其中的作用就显得尤为重要，启动子的特性往往决定着一个基因的表达特性[23]。因此，为更加深入地研究 S6PDH的表达特性与功能，对该基因启动子的研究就显得必不可少，但目前关于该基因启动子的研究还很少，只有个别研究探索了该启动子的特性[24-26]。为了更深入地分析 S6PDH基因启动子的功能特性，本研究从目前栽培苹果的主要砧木楸子中克隆到该启动子，然后在构建启动子——报告基因融合表达载体的基础上瞬时转化烟草叶片，最后通过转基因烟草叶片中报告基因的表达量分析该启动子的表达特性。研究结果为深入探索 S6PDH基因及其启动子的表达模式和功能特性奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

3 a生楸子(Malusprunifolia)叶片用于DNA提取及启动子克隆。烟草(Nicotianatabacumcv. NC89)种子经4 ℃低温锻炼7 d后，播种于已灭菌的基质中，覆盖保鲜膜保湿，于温室中培养至出苗[约3～4周，光照16 h(25 ℃)和黑暗8 h(20 ℃)]，然后再培养至合适大小时用于农杆菌介导的瞬时转化分析。

1.2 启动子克隆与序列分析

楸子叶片基因组DNA 的提取参考CTAB法[27]。根据以前研究获得的苹果 S6PDH基因启动子序列[24]设计上游引物S1和下游引物A1(S1：5′ -GAAGGGGTGGCTCAAGTGTA-3 ′；A1：5′-CATCTCGTAGCCACTGCTCA-3′)，以提取的楸子叶片DNA为模板，利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR(TaKaRa)进行PCR 扩增(扩增体系与程序参照说明书)。扩增产物经80 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段并与pMD18-T(TaKaRa)载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞Top10，菌液PCR筛选呈阳性的克隆送至测序公司进行测序。将测序正确的序列命名为Mp-S-P并提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)进行在线顺式作用元件预测，在DNAMAN软件中预测限制性酶切位点。

1.3 启动子-GUS基因融合表达载体构建

根据Mp-S-P序列的酶切位点分析结果，并结合瞬时表达载体 pC0390-GUS(该载体中GUS前无启动子)的多克隆位点设计上游引物S2和下游引物A2(S2：5′-CGCGTCGACGAAGGGGTGGCTCAAGTGTA-3′；A2：5′-TCCCCCGGGGT TTTCTCACTCTCCAAACT-3′)，以含有该启动子序列的克隆载体为模板，通过PCR反应引入酶切位点SalⅠ和SamⅠ(序列见引物下划线部分)，并将扩增产物克隆至pMD-T Simple(TaKaRa)载体中。同时用SalⅠ和SamⅠ酶切载体 pC0390-GUS和带有酶切位点的克隆载体，37 ℃酶切3 h 后经电泳分离，回收目的片段，并进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10后进行测序验证。提取序列正确的单菌落质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，在含庆大霉素和卡那霉素的培养基中筛选阳性单菌落用于烟草叶片瞬时转化。

1.4 农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化

将经检测的含有pMp-S-P-GUS融合载体的农杆菌菌株培养至OD600为0.6～0.8，然后用注射器人工注入烟草叶片，具体参照Sparkes等[28]的方法。以含有 pC0390-35S-GUS(CaMV35S驱动GUS基因表达)和 pC0390-GUS(没有启动子驱动GUS基因表达)载体的农杆菌菌液采用相同的方法注射后分别作为阳性对照(P)和阴性对照(N)。

1.5 GUS蛋白活性检测

检测原理：GUS能以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖酸苷(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，4-MUG)为底物，使之水解为4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)与β-D-葡萄糖醛酸。4-MU为荧光物质，能被365 nm的光激发，产生455 nm的荧光，产生的荧光值由荧光分光光度计定量。酶活力单位定义：每分钟水解 4-MUG 生成1 nmol/L或1 μmol/L 4-MU的酶量作为一个活力单位，以每毫克蛋白的酶活力来计算，结果表示成4-MU nmol/min/mg Protein。具体流程参考Jefferson[29]的方案。

1.6 胁迫和外源生长调节剂处理

对瞬时转化的烟草幼苗进行100 μmol/L脱落酸(ABA)、200 μmol/L 赤霉素(GA3)、1 mmol/L水杨酸(SA)、100 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)及避光和低温(4 ℃)处理。ABA、GA3、SA和MeJA直接喷施于经瞬时转化的烟草叶片，以喷施等量水为对照，喷雾后放入培养箱培养24 h(条件同“1.1”)后检测GUS蛋白活性。避光和低温处理24 h，以正常条件(同“1.1”)下培养的瞬时转化植株为对照，检测GUS蛋白活性。

2 结果与分析

2.1 启动子克隆与序列分析

根据以前获得的苹果 S6PDH基因启动子序列设计特异引物，通过PCR扩增获得了楸子 S6PDH基因启动子序列，经测序后发现该序列的长度为2 364 bp，并命名为Mp-S-P(图1)。将Mp-S-P与以前研究获得的 S6PSH基因启动子序列进行比对后发现，二者在DNA序列结构上非常相似，序列之间的相似性达到97%，只有个别的地方存在碱基的差异或缺失/插入。

将Mp-S-P序列提交到PlantCARE网站进行启动子序列分析，结果发现许多重要的顺式作用元件(表1和图1)。除了典型的与转录起始相关的TATA-box元件和CAAT-box元件外，Mp-S-P上还存在许多与光响应相关的元件，如ACE、CATT-motif、G-box、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MRE、Spl、chs-CMA2a和circadian等。还发现几个与逆境胁迫相关的元件，如LTR、MBS和TC-rich repeats等。另外，还发现一些响应植物激素的元件，如响应茉莉酸甲酯的CGTCA-motif和TGACG-motif、响应乙烯的ERE、响应赤霉素的GARE-motif和P-box和响应水杨酸的TCA-element等。

根据这些预测分析结果，可以发现Mp-S-P序列中存在着大量的与生物和非生物逆境胁迫相关的元件，表明楸子 S6PDH基因及其启动子能参与多种胁迫响应，并在抗逆防御反应过程中发挥重要的调控作用。

起始密码子以实线框标出。与已鉴定的顺式作用元件同源的基序用阴影标识，其对应的元件名称在阴影下标出。向左的箭头表示与启动子方向相反的顺式作用元件。

2.2 不同处理下GUS蛋白活性分析

为进一步分析和验证Mp-S-P的功能，本研究将该启动子与GUS融合并瞬时转化烟草叶片，然后对这些转基因烟草进行ABA、GA3、SA、MeJA、避光和低温处理，处理之后收集叶片，分析其中GUS蛋白活性，用来反映Mp-S-P的活性。

结果如图2所示，在持续低温处理下(图2-A)，GUS蛋白的活性被极显著地诱导，达到对照(常温处理)的6.79倍，明显高于对照活性，表明低温处理显著提高了Mp-S-P的活性。在避光处理24 h后(图2-B)，处理组中GUS活性显著降低，只有对照组的30%左右，表明避光处理可以降低Mp-S-P的活性。研究还使用外源SA(图2-C)、ABA(图2-D)、GA3(图2-E)和MeJA(图2-F)喷施转基因烟草，结果发现SA(图2-C)和GA3(图2-E)处理均可以显著提高烟草叶片中GUS蛋白的活性，分别比它们各自的对照提高10.54和1.34倍，表明以上这些外源生长调节剂可以诱导Mp-S-P的表达。但与对照相比，ABA(图2-D)处理和MeJA(图2-F)处理却降低了Mp-S-P的活性，因为其对应的GUS蛋白活性只有对照的0.77和0.91倍。各种处理在阳性对照和阴性对照中差异均不显著。

表1 楸子 S6PDH基因启动子顺式作用元件Table 1 cis-elements in S6PDH promoter sequence of Malus prunifolia

3 讨 论

通过同源克隆法，本研究获得了楸子 S6PDH基因上游2 364 bp的启动子序列。经序列相似性比对发现，本研究获得的启动子序列与课题组以前获得的苹果主栽品种‘嘎啦’(Malusdomesticcv. Gala)的 S6PDH基因启动子序列一致性达到97%以上[24]，它们的差异类型只是一些碱基的变异和缺失。另外，楸子(数据未发表)和栽培苹果中 S6PDH基因序列[30]也完全一致。这些结果表明，山梨醇作为蔷薇科植物特有的一种主要初生代谢产物，其合成关键基因及其上游序列是非常保守的。

A.低温 Cold；B.避光 Dark；C.水杨酸 SA；D.脱落酸 ABA；E.赤霉素 GA3；F.茉莉酸甲酯 MeJA

苹果[15]、梨[16]、桃[31]和枇杷[32]中的研究发现， S6PDH表达量和酶活性随着叶片的生长发育过程而不断增加，当叶片的光合能力最大时达到最高值。这表明 S6PDH的表达与光照密切相关，其表达可能受到光的调控。在现在的研究结果中，笔者通过生物信息学分析发现Mp-S-P中存在大量的光响应元件(表1和图1)，如ACE、G-box、CATT-motif、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MRE、Spl、chs-CMA2a和circadian等，这与栽培苹果中的研究是一致的[24]。为了验证Mp-S-P是否受到光的调控，笔者对转入pMp-S-P-GUS融合载体的转基因烟草进行了避光处理，结果发现GUS活性显著降低，表明Mp-S-P的活性受到光的诱导表达。在以前的研究中发现，栽培苹果中的 S6PDH基因启动子也有相类似的表达特性[24]。但对比栽培苹果和楸子的 S6PDH基因启动子却可以发现它们二者在光响应元件的种类和数量上存在一定的差异。这些结果从一定程度上表明苹果属植物 S6PDH基因启动子中都有很多的光响应元件，而且这些元件之间的功能很可能可以互补。

山梨醇作为一种小分子物质，可以在植物抵御生物和非生物逆境时大量积累， S6PDH的表达也是如此[3,17,19]。本研究也在Mp-S-P序列中发现了一些直接与抗逆有关的元件，如LTR、MBS和TC-rich repeats等，而且还发现了与生物逆境应激反应相关的CGTCA-motif、TGACG-motif和TCA-element等元件。为了证明这些元件是否能够产生逆境响应的功能，笔者对转入pMp-S-P-GUS融合载体的转基因烟草进行了不同的逆境处理和外源生长调节剂处理，结果发现低温、SA和GA3处理组中的GUS活性显著高于对照组，黑暗处理中的GUS活性显著低于其对照，这些可能和Mp-S-P序列中存在相应的响应元件有关(相关功能见表1)。以前在栽培苹果中也发现 S6PDH基因启动子活性在低温条件下上调表达，而在黑暗条件下下调表达[24，26]。诱导研究还发现，ABA和MeJA处理降低了GUS活性。根据生物信息学的分析结果，在整个Mp-S-P序列中有多个响应MeJA的元件，如CGTCA-motif和TGACG-motif，但为什么该启动子活性在MeJA诱导下没有上调，其原因还需进一步研究。在栽培苹果 S6PDH基因启动子序列中还存在1个响应ABA的元件——ABRE，因此可以响应ABA的诱导[24]。但由于碱基发生了变异，本研究获得的Mp-S-P序列中没有发现这个顺式作用元件，这也可能是楸子 S6PDH基因启动子在ABA诱导下下调的原因，但这些还需更多的研究来验证。

综上所述，以上的结果初步证明该启动子具有光和逆境响应特性，也从一定角度解释了 S6PDH的表达、酶活性及山梨醇含量在不同条件下增加的机制。但本研究只是进行了整个全长启动子的表达特性分析，下一步还可以通过构建5′系列缺失体来深入研究不同元件在启动子表达过程中的作用机制，并分析不同长度启动子对各种外界条件的响应。

4 结 论

研究获得了2 364 bp的楸子 S6PDH基因上游启动子序列并命名为Mp-S-P。序列分析发现Mp-S-P中存在多个元件，除基本的转录起始元件外，还有光响应元件、胁迫响应元件和激素响应元件。研究还应用农杆菌介导的模式植物烟草瞬时表达系统分析了获得的启动子序列的表达特性，发现该序列可以被避光、低温、SA、ABA、GA3和MeJA等外界条件诱导。