乙型肝炎病毒与戊型肝炎病毒重叠感染患者T淋巴细胞变化及相关临床危险因素分析

王天宝，王 扬，罗 磊，毕研贞，马正来，吕 君，李德旭，朱 斌

(1.新乡医学院第一附属医院感染疾病科二病区，河南 卫辉 453100；2.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合肝病中心，北京 100069；3.首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病与人工肝中心，北京 100069；4.首都医科大学肝病转化研究所，北京 100069；5.郑州大学第一附属医院感染科，河南 郑州 450052；6.郑州大学第一附属医院肝胆胰脾外一科二病区，河南 郑州 450052)

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)流行地区，20%～40%的慢性乙型肝炎患者存在重叠感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)的风险，尤其是在亚洲、非洲、拉丁美洲经济不发达地区，HBV与HEV重叠感染可能导致慢加急性肝衰竭[1-5]，严重者可导致死亡，需要及时治疗干预[6-8]。CD4+T淋巴细胞参与HBV和急性HEV感染的发病过程[9-13]，但在HBV与HEV重叠感染患者中，T淋巴细胞数目变化特点及相关的临床因素尚不清楚。本研究旨在探讨HBV与HEV重叠感染患者的T淋巴细胞数量变化及重叠感染相关的临床危险因素。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2001年8月至2012年7月新乡医学院第一附属医院收治的28例HEV感染患者及首都医科大学附属北京佑安医院收治的58例HEV感染患者为观察对象。86例患者中，男65例，女21例；年龄39～94(67.55±9.37)岁；患者均符合病毒性肝炎诊断标准[14]。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)患者均知情同意，并签署知情同意书。排除标准：(1)其他原因造成的肝病或合并其他病毒感染，包括同时感染丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒者，或存在自身免疫性肝病；(2)有其他重大疾病，如严重心脏病、肾脏疾病等；(3)有恶性肿瘤病史，包括原发性肝癌、原位癌和肝脏不典型增生结节；(4)有肝硬化病史或B型超声、CT等影像学检查提示肝硬化者；(5)入组前6个月接受皮质类固醇药物、免疫抑制剂或化学治疗药物者。86例患者根据是否同时存在HBV感染分为HEV感染组和重叠感染组，其中HEV感染组74例，男57例，女 17例，年龄60～94(69.38±7.54)岁；重叠感染组12例，男8例，女4例，年龄39～75(56.25±11.81)岁。本研究获得新乡医学院第一附属医院及首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会批准。

1.2血清学指标实验室检查

1.2.1标本采集及处理所有患者于晨起空腹状态下采集肘前静脉血约20 mL，分别保存于6个一次性真空采血管(英国Becton Dickinson and Company公司)，其中肝素抗凝管、枸橼酸钠凝血管和乙二胺四乙酸抗凝管各1个，惰性分离胶促凝管3个。室温静置约1 h，待其自行凝固，TDL80-2B常温台式离心机(上海安亭科学仪器厂)2 000 r·min-1离心10 min，取上清液备用。肝素抗凝管血浆用于生物化学检测，包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、γ-谷氨酰转移酶(glutamyltransferase，γ-GGT)、白蛋白(albumin，ALB)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)和胆固醇(cholesterol，CHOL)；惰性分离胶促凝管血清用于甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、IgA、IgM、IgG、C3、C4以及甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)抗体、HBV相关抗原及抗体、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗体、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)抗体、HEV抗体、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)抗体、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)抗体和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗体；枸橼酸钠凝血管血浆用于凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)检测；乙二胺四乙酸抗凝管血浆用于T淋巴细胞亚群检测，包括CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。

1.2.2血生物化学指标检测肝功能血清标志物的检测中，ALT检测采用国际临床化学委员会推荐法为基础设计的两步法，AST检测采用紫外-苹果酸脱氢酶法，DBIL和TBIL检测采用钒酸盐氧化法，γ-GGT检测采用L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法，ALB检测采用溴甲苯绿法，ALP检测采用2-氨基-2甲基-1-丙醇法，TBA检测采用循环酶法，FBG及CHOL检测采用氧化酶法，检测仪器为日本Olymous公司AU系列全自动生物化学检测仪，试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司。AFP检测采用电化学发光免疫法，仪器为瑞士罗氏Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析系统，试剂购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。PTA检测采用凝固法，使用仪器为日本希森美康公司SysmexCA-7000凝血分析仪，试剂为配套试剂。所有操作流程按试剂盒说明书进行。

1.2.3血肝炎病毒学标志物检测采用电化学发光免疫法检测HBV标志物，包括HBsAg、HbeAg和HBeAb，仪器为瑞士罗氏公司Cobas全自动电化学发光免疫分析系统，试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司。HBV DNA定量检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应法，使用瑞士罗氏公司Cobas®AmpliPrep-TaqMan平台，试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。采用酶联免疫吸附试验检测其余肝炎病毒学标志物，包括HAV、HCV、HDV、HEV、CMV、EBV和HIV抗体，检测仪器为西班牙基立福公司变色龙triturus全自动酶免分析仪，试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司或北京万泰生物药业股份有限公司。所有操作流程按试剂盒说明书进行。

1.2.4T淋巴细胞亚群及免疫5项检测采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群，包括CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，检测仪器为美国BECTON DICKINSON公司的FACSCalibur流式细胞分析分选系统，三色单克隆抗体试剂(CD3 PerCP/CD4FITC/CD8 PE，BECTON DICKINSON公司)购自美国BD公司。采用免疫比浊法检测免疫5项，包括IgA、IgM、IgG、C3和C4，检测仪器为德国西门子公司BNTMⅡ全自动蛋白分析系统，使用西门子配套试剂，所有操作均按照厂家操作说明书进行。

2 结果

2.12组患者一般临床资料及血生物化学指标结果比较结果见表1。重叠感染组患者的年龄、ALT和PTA均低于HEV感染组患者，差异有统计学意义(Z=-3.588、-2.044，t′=-6.720，P<0.05)。2组患者性别构成、住院时间及AST、TBIL、DBIL、γ-GGT、ALB、AFP、ALP、FBG和CHOL水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组患者一般临床资料及血生物化学指标比较

2.22组患者T淋巴细胞亚群及免疫5项结果比较结果见表2。重叠感染组患者CD8+T淋巴细胞计数显著低于HEV感染组，CD4+T/CD8+T显著高于HEV感染组，差异有统计学意义(Z=-2.175、-2.091，P<0.05)。2组患者CD3+T淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞计数及IgA、IgM、IgG、C3、C4水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组患者T淋巴细胞亚群及免疫5项结果比较

2.3与HBV重叠感染HEV患者相关的多因素分析将年龄、ALT、PTA及CD8+T淋巴细胞计数带入多因素回归分析，结果显示(表3)，PTA与HBV重叠感染HEV有相关性(OR=1.056，95%可信区间为1.009～1.105，P<0.05)。

表3 与HBV重叠HEV感染患者相关的多因素分析

2.4年龄、ALT和PTA与T淋巴细胞亚群及免疫5项水平之间的相关性结果见表4。Spearman分析结果表明，PTA与C3水平呈正相关(r=0.37，P<0.05)，PTA与IgA水平呈负相关(r=-0.53，P<0.05)，其他各指标之间无相关性(P>0.05)。

表4 年龄、ALT和PTA与T淋巴细胞亚群及免疫5项水平之间的相关性

注：aP<0.05。

3 讨论

我国HBV感染者比例约为7.18%，由于各类型嗜肝病毒之间缺乏交叉免疫，HBV感染者仍存在重叠感染HEV的可能[6，14-15]。机体免疫参与HBV或HEV感染的病程，但HBV重叠感染HEV患者机体免疫状态的改变以及与HBV重叠感染HEV患者相关的临床因素鲜有报道。本研究结果显示，HBV与HEV重叠感染患者CD8+T淋巴细胞计数显著低于HEV感染患者，PTA水平降低与HBV重叠感染HEV独立相关。

HBV与HEV重叠感染患者的肝功能损害程度可能重于HEV感染者。有研究报道，HBV与HEV重叠感染患者TBIL和ALT水平明显高于HEV感染患者，而PT和PTA明显低于HEV感染者[15]。本研究结果显示，HBV与HEV重叠感染组患者PTA水平明显低于HEV感染组，但是ALT水平低于HEV感染组，而TBIL水平与HEV感染组比较差异无统计学意义；该结果提示，与ALT和TBIL比较，PTA更能持久反映肝功能损害的严重程度。

HBV与HEV重叠感染对患者肝功能的损害可能与HBV、HEV感染类似，同样依赖于宿主免疫系统作用于肝细胞[16-18]。有研究表明，HEV感染者外周血T淋巴细胞亚群计数显著高于无HEV感染者[19]。另有研究报道，与健康者比较，HEV感染者外周血T淋巴细胞亚群在急性感染期和恢复期差异并不显著[20]。本研究中，HBV与HEV重叠感染患者CD8+T淋巴细胞计数显著低于HEV感染患者。为了进一步探讨HBV重叠感染HEV患者肝功能损伤与机体免疫状态之间的关系，本研究选择了年龄、ALT和PTA这3个最有可能反映重叠感染患者特征的临床因素，进一步分析其与淋巴细胞亚群及免疫5项水平之间的相关性，结果显示，PTA与C3水平呈正相关，与IgA水平呈负相关。提示PTA与体液免疫调节存在部分交叉，但其具体调节机制有待于进一步研究。

综上所述，与HEV感染患者相比，HBV与HEV重叠感染患者CD8+T淋巴细胞明显下降。PTA与HBV重叠感染HEV密切相关，是重叠感染的独立危险因素，提示针对CD8+T淋巴细胞和PTA改善肝细胞功能的治疗策略可能是此类患者临床治疗的一种选择。同时应当注意，本研究也存在着不足，如HBV重叠感染HEV患者的病例数较少，重叠感染前的基础免疫状态未进行评估，病程中机体免疫状态的动态演变及其对病程转归的影响，仍值得进一步研究。