枸杞多糖体外抗肿瘤及免疫学

孙云龙 庞 博 刘 鑫 褚 颖 (长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，是我国的传统药材〔1〕。枸杞子具有滋阴补血、益气明目之功效〔2〕。现代药理研究表明，枸杞具有良好的免疫调节功能，能够延缓衰老及抗氧化〔3〕、抗辐射损伤、降血糖〔4〕、降血脂〔5〕、保护生殖系统〔6〕及促进肿瘤细胞凋亡〔7〕。枸杞多糖为枸杞中最重要的成分，是一种复杂的混合物，尽管人们对枸杞多糖的结构进行了多方面的研究并取得了很多成果，但目前枸杞多糖发挥免疫调节及抗肿瘤作用的机制尚未十分清楚〔8〕。本文研究枸杞多糖在体外的抗肿瘤作用及其发挥免疫调节的机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 CO2培养箱(美国Thermo Electro Corporation)，CKK-41荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，超净工作台(AIR TECH)，高速冷冻离心机(美国Sigama公司)，Rainbow酶联免疫酶标测定仪(奥地利Tecan公司)，OlympusbX51凝胶成像系统(日本O-lympus公司)，DGG-9030电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)，LNG-T83台式离心浓缩仪(江苏太仓医疗器械厂)。

1.2 细胞株及试剂 细胞株 RAW264.7、HepG2、SGC-7901及K562均购自中国科学院上海细胞库。枸杞多糖为实验室通过水提醇沉法制备并精制(纯度为65.2%)，RPMI1640培养基、DMEM高糖培养基、特级胎牛血清(美国 Gibco公司)，Trypsin(美国 Sigma公司)，青-链霉素双抗(长春华大中天公司)，抗体(武汉三鹰生物科技公司)，细胞计数试剂盒(CCK)-8、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、聚氰基丙烯醇正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒、酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(碧云天生物科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 CCK-8法测体外肿瘤细胞增殖抑制作用 人肝癌细胞 HepG2、胃癌细胞 SGC-7901及白血病细胞K562培养于DMEM/F12(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)培养液中，置培养箱内5%CO237℃培养。取对数生长期的细胞消化，以1×104个的密度接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100 μl，于细胞培养箱中继续培养，待细胞融合度达70%～80%，给药处理。每孔加药10 μl，每个浓度平行6个复孔。阳性对照组中加1 mg/L顺铂，阴性对照组加入等量无血清无抗生素的RPMI1640培养基，培养箱中培养 48 h，实验组分别加入浓度为 10、50、100、200、400 μg/ml枸杞多糖处理 48 h后，每孔中加入 10 μl CCK-8溶液，继续培养箱中孵育2～4 h，使用酶标仪测定450 nm处OD值，计算抑制率，抑制率%=1－(OD给药组/OD阴性对照组)×100%。

1.4 Western印迹实验 取对数生长期的SGC-7901细胞，接种于6孔板，密度1×105个，于37℃，5%CO2条件下培养过夜，分别加入浓度为 50、100、200、400 μg/ml枸杞多糖处理48 h，阳性对照组加入紫杉醇1 mg/L，空白对照组加入无血清无抗生素RPMI1640培养基，处理48 h。将细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物和100 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的预冷裂解缓冲液中裂解5 min。在10%SDS-PAGE上分离蛋白质，通过湿法电泳转移到NC膜上，并用5%脱脂奶粉在三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBST)缓冲液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl和0.2%吐温20)室温中封闭1 h。将膜与一抗在4℃下孵育过夜，二抗孵育1 h，用TBST缓冲液洗涤并使用增强的化学发光试剂(ECL)显现免疫反应条带。

1.5 ELISA法检测枸杞多糖对单核巨噬细胞RAW264.7肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌的影响 选择对数生长期的RAW264.7细胞，接种于96孔板，密度1×104个，于37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组按照 100、200、400 μg/ml剂量加入枸杞多糖，空白对照组加入等量无血清无抗生素RPMI1640培养基，阳性对照组加入10 μg/ml的脂多糖(LPS)，放入37℃，5%CO2中培养。24 h后取上清，用ELISA试剂盒进行检测。按照一定的浓度梯度配制血清细胞因子 TNF-α、IL-1β、GM-CSF 标准溶液，以绘制标准曲线。样品及标准品均于37℃孵育2 h，弃上清。除空白对照组外各孔分别加入生物素化小鼠TNF-α、IL-1β、GM-CSF 抗体 50 μl，于 37℃孵育 90 min，弃上清。用冲洗液冲洗，之后加入Streptavidin-辣根过氧化物酶(HRP)溶液100 μl，室温孵育 30 min，弃上清，加入酶反应底物 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺 (TMB) 溶液100 μl，室温避光孵育 15 min，加入 100 μl终止液停止孵育，使用酶标仪读取450 nm处吸光度值，绘制标准曲线并计算TNF-α、IL-1β及GM-CSF的含量。

1.6 统计学方法 使用SPSS21.0进行t检验。

2 结果

2.1 枸杞多糖对肿瘤细胞的增殖抑制作用 枸杞多糖浓度在 200 mg/L时，对 SGC-7901、K562、HepG2细胞增殖有较强抑制作用，但抑制率明显低于阳性对照组。见表1。

表1 枸杞多糖对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用(n=6，)

表1 枸杞多糖对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用(n=6，)

与阴性对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 SGC-7901K562HepG2 OD值 抑制率(%)OD值 抑制率(%)OD值 抑制率(%)阴性对照组 0.790±0.04 － 0.780±0.04 － 0.764±0.03 －阳性对照组(DDP) 0.252±0.032) 68.10±8.11 0.161±0.032) 79.36±14.79 0.257±0.082) 66.36±20.66枸杞多糖 10 mg/L 0.747±0.021) 5.44±0.15 0.726±0.041) 6.92±0.38 0.733±0.011) 4.06±0.06 50 mg/L 0.706±0.052) 10.63±0.75 0.713±0.021) 8.59±0.24 0.697±0.041) 8.77±0.50 100 mg/L 0.702±0.082) 11.14±1.27 0.699±0.071) 10.38±1.04 0.683±0.091) 10.60±1.40 200 mg/L 0.563±0.042) 28.73±2.04 0.655±0.032) 16.03±0.73 0.570±0.052) 25.39±2.23 400 mg/L 0.678±0.072) 14.18±1.46 0.707±0.042) 9.36±0.53 0.564±0.042) 26.18±1.86

2.2 Western印迹实验结果 枸杞多糖能够抑制Caspase-8，Bcl-2蛋白的表达，促进Bax蛋白的表达，但促进及抑制作用均弱于阳性对照组，见图1。

2.3 ELISA法检测枸杞多糖对单核巨噬细胞RAW264.7 TNF-α、IL-1β及GM-CSF分泌的影响 枸杞多糖对RAW264.7分泌TNF-α有较弱的促进作用，其促进效果不及阳性对照组;枸杞多糖能够促进RAW264.7分泌IL-1β，效果为空白对照组的3～6倍，其中400 μg/ml组的促进效果可与阳性对照组持平;枸杞多糖能够促进RAW264.7细胞分泌GM-CSF，效果为空白对照组的4～6倍，但促进效果远不及阳性对照组。见表2。

图1 枸杞多糖对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-8及Bax的作用

表2 枸杞多糖对RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、GM-CSF的影响(，n=6，pg/ml)

表2 枸杞多糖对RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、GM-CSF的影响(，n=6，pg/ml)

与空白对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 TNF-α IL-1β GM-CSF空白对照组 728.13±100.90 6.73±0.54 6.56±0.57阳性对照组 2 426.50±258.412) 360.00±4.902) 452.44±59.802)枸杞多糖 100 μg/ml 924.50±76.801) 19.73±2.472) 26.75±3.722)200 μg/ml 1 078.38±109.602) 30.46±2.862) 27.06±3.172)400 μg/ml 1 202.50±113.762) 35.18±4.072) 34.72±4.982)

3 讨论

中药材重金属含量测定的联查报告数据证实常见的各种中药材中，枸杞的重金属含量测定全部显示无污染〔9〕，所以枸杞以其良好的生物安全性被医学界广泛关注，其中枸杞多糖为枸杞的最主要成分，且枸杞多糖在抗肿瘤、免疫调节等方面上都有明显的效果〔10，11〕。本实验结果发现，枸杞多糖浓度在200 mg/L时对SGC-7901、HepG2细胞增殖有抑制作用，对K562有较弱的增殖抑制作用，表明枸杞多糖可以通过抑制肿瘤细胞的生长来起到抗肿瘤作用。

巨噬细胞在免疫系统中地位比较重要，吞噬细胞(中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)是对病原微生物入侵最早做出应答的细胞类型，是天然免疫应答的主要参与者〔12，13〕，激活的巨噬细胞能抑制多种肿瘤细胞和病原微生物〔14〕，与肿瘤的治疗息息相关。枸杞多糖可能是枸杞中起到免疫调节的主要成分，认为其抗肿瘤可能与枸杞多糖的免疫增强作用有关，可能机制有:抑制肿瘤细胞的生长，使TNF活性升高;对肿瘤细胞周期，血管生成、凋亡产生影响;和其他化疗药物联合应用时具有协同抗肿瘤作用〔15，16〕。本研究表明，枸杞多糖是通过激活巨噬细胞，促进IL-1β、TNF-α和GMCSF产生而发挥免疫作用的。

人Bcl-2是一个定位于核膜部分位于内质网和线粒体外膜的癌蛋白，可保护细胞免于凋亡，延长细胞寿命，在成熟或即将被消除的细胞中表达下降，其同源基因Bax可拮抗Bcl-2的保护作用而使细胞趋于凋亡，紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种新型广谱抗癌药，现广泛应用于各种晚期肿瘤的治疗，疗效显著〔17〕，所以在本实验中以紫杉醇作为对照。本研究表明，枸杞多糖具有抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤细胞增长，促进分泌血清细胞因子，上调促凋亡蛋白和下调抑制凋亡蛋白来实现的。

肿瘤治疗的一般手段就是手术、放疗和化疗，但是费用昂贵且治愈率低，目前对肿瘤的治疗效果仍不理想，因此目前从中草药中开发具有抗肿瘤的活性成分已经成为当前抗肿瘤药物的研究热点。中药多糖以其抗肿瘤活性、免疫活性而备受关注，且毒副作用较小〔18〕。本实验表明，枸杞多糖具有体外细胞增殖抑制作用，但是其抑制作用不如顺铂，其抑制作用的机制尚未进行研究，可通过后续研究进行深入、全面、系统的分析研究。