丹参酮ⅡA对硫酸吲哚酚诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

许玲玲 鲁明军 郭 涛 苏 楠 王 敏 吴琳英 罗福全 耿庆山 黄伟青(广州医科大学附属第一医院心内科，广东 广州 5020)

晚期慢性肾脏病患者由于胃肠功能和肠道微生态的紊乱〔1，2〕，导致多种尿毒症毒素蓄积，主要包括硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚等。尿毒素IS能够引起心血管内皮细胞功能失调、凋亡、动脉钙化，引起心血管事件发生率升高，从而导致患者死亡率明显升高〔3，4〕。目前研究表明，尿毒素IS能够通过氧化应激、激活核因子(NF)-κB通路等损伤血管内皮细胞，最终导致心功能不全及血管硬化等病理改变〔5，6〕。因此，抑制尿毒素IS介导血管内皮细胞损伤具有重要意义。

丹参酮ⅡA在中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)中的含量较高，有较强的生理活性，是丹参主要有效成分之一，具有天然抗氧化、抗炎和心血管药理保护作用，广泛用于心血管病及尿毒症患者治疗〔7，8〕。尿毒症患者血清IS水平波动在50～240 μg/ml，同时有文献报道〔4〕100 μg/ml IS 可引起内皮细胞明显损伤，本研究拟采用100 μg/ml IS进行研究，旨在观察IS对血管内皮细胞的影响及丹参酮的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及试剂 人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)购自美国ATCC。IS购自美国Sigma公司，丹参酮ⅡA购自上海融禾生物科技公司，胎牛血清(FBS)、胰酶、RIPM1640培养基购自美国Gibco公司，DAPI染色液、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自碧云天公司，Annexin/PI双染试剂盒购自凯基生物技术公司。

1.2 细胞培养 将内皮细胞置于含10%FBS及青霉素、链霉素各 100 U/ml的 RPMI1640培养液中，在37℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度培养箱培养;细胞呈单层贴壁生长后2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 实验分组 内皮细胞以适当密度转种，实验前换用0.5%RPMI1640培养液同步16 h后。加入不同浓度的丹参酮ⅡA和(或)100 μg/ml的IS，于含10%FBS的RPMI1640培养液中继续培养24 h。实验分为正常组、IS 组、IS+丹参酮ⅡA 不同浓度(2 μg/ml和10 μg/ml)组。

1.4 倒置相差显微镜观察内皮细胞形态学改变 观察各组刺激细胞12、24 h细胞形态学变化。实验结束时各组细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，奥林巴斯EX71倒置显微镜观察内皮细胞形态学变化并拍照。

1.5 培养上清LDH检测 实验结束时转移培养上清至10 ml离心管，1 200 r/min离心5 min，吸取上清，按照LDH检测试剂盒说明书检测，采用化学发光法测定各组细胞上清LDH水平。

1.6 DAPI法行细胞核染色 细胞传代至6孔板，同步后加刺激孵育至24 h、4%多聚甲醛4℃固定20 min，0.5%Triton X-100透膜10 min，PBS洗涤2次。加入DAPI染色液，覆盖细胞表面，避光孵育20 min，PBS洗涤2次，荧光显微镜观察细胞核情况。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 细胞传代至6孔板，同步后加刺激孵育至所需时间，吸弃培养液，无乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化细胞，终止消化，离心，PBS洗涤1次，离心，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC工作液，混匀，加入5 μl PI工作液，避光，室温孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 各组内皮细胞形态学变化 与正常组相比，IS组刺激12 h后内皮细胞明显损伤，细胞变性，至24 h损伤加重，细胞变圆、皱缩。2 μg/ml丹参酮ⅡA对IS组诱导内皮细胞损伤的保护作用并不明显，但10 μg/ml明显改善细胞学形态变化，细胞变性减轻，细胞皱缩、变圆情况好转，见图1。

图1 各组12、24 h细胞形态学变化(×200)

2.2 丹参酮ⅡA可抑制IS诱导内皮细胞LDH释放

与正常组比较，IS组12 h后可引起内皮细胞培养上清LDH释放明显增加，24 h LDH水平进一步上升，呈现显著的细胞损伤(P＜0.05)。IS+丹参酮ⅡA 2 μg/ml组24 h培养液上清LDH水平较IS组明显下降(P＜0.05)，IS+丹参酮ⅡA 10 μg/ml组 12、24 h 培养液上清LDH水平较IS组均有明显下降(P＜0.05)，见表1。

表1 各组培养上清LDH释放量比较(，n=3，U/L)

表1 各组培养上清LDH释放量比较(，n=3，U/L)

与正常组比较:1)P＜0.05;与IS组比较:2)P＜0.05

组别 12 h 24 h正常组 4.1±0.6 4.7±0.7 IS 组 11.4±1.11) 14.5±1.81)IS+丹参酮ⅡA 2 μg/ml组 9.2±1.3 11.2±1.12)IS+丹参酮ⅡA 10 μg/ml组 7.8±0.82) 9.4±0.92)

2.3 丹参酮ⅡA可抑制IS诱导内皮细胞凋亡 DAPI法染色后在荧光显微镜下观察，正常组细胞核呈正常的蓝色，形态饱满，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色发亮。结果显示IS组内皮细胞发生显著凋亡，而IS+丹参酮ⅡA 10 μg/ml组治疗后内皮细胞凋亡可明显改善，见图2。

图2 DAPI法检测细胞核情况(×200)

Annexin V-FITC/PI双染法结果发现，IS组内皮细胞凋亡率(40.3%±4.5%)显著高于正常组(4.2%±0.5%，P＜0.01)，IS+丹参酮ⅡA 10 μg/ml组(24.6%±3.0%)显著高于正常组，但显著低于IS组(P＜0.05)，见图3。

图3 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况

3 讨论

尿毒素蓄积是晚期慢性肾脏病患者发生心血管事件的重要原因之一，寻找有效措施，抑制尿毒素如IS等的生物学效应具有重要意义。丹参是中医学宝库中的理血药，丹参酮A是丹参主要有效成分之一。现代研究表明丹参酮ⅡA具有显著的抗氧化及心血管保护作用，在尿毒症患者及心血管病患者中运用广泛〔7〕。丹参酮ⅡA能够有效减少DNA加成物的细胞毒性，消除细胞内脂质过氧化产物——脂类自由基，从而有效保证线粒体呼吸功能。丹参酮ⅡA能够保护内皮细胞功能，抑制平滑肌细胞增殖，进而体现出抗动脉粥样硬化作用。而通过静脉注射丹参酮ⅡA，能够有效降低心脏体积、左心室壁张力，降低心肌耗氧量，有效的治疗缺血性冠心病，同时能够缩小心肌梗死范围〔9～11〕。

本研究结果表明，尿毒素IS能够引起HUVECs发生明显损伤变性，上清LDH释放量明显增多，细胞发生显著凋亡。丹参酮ⅡA能够减轻IS诱导的内皮细胞损伤变性，细胞凋亡率较单纯IS组也明显减轻。丹参酮ⅡA对晚期慢性肾脏病患者的心血管有保护作用，但治疗作用的机制仍需进一步研究。