雌激素通过雌激素受体α上调载脂蛋白M的表达

魏江，于洋，罗光华，张俊，徐宁，张晓膺（.苏州大学附属第三医院综合实验室，江苏常州3003；.瑞典Lund大学临床化学系S-85）

载脂蛋白M（ApoM）主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，少部分存在于低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白中[1]。其有8股反向β折叠片段，从而形成疏水性结合域，这样就与一些亲脂小蛋白分子结合，如视黄醇、肉豆蔻酸及1-磷酸鞘氨醇（S1P），从而发挥相应作用。ApoM能促进前β-HDL颗粒形成及成熟，而β-HDL的主要功能是促进细胞内胆固醇的外流，从而发挥其抗动脉粥样硬化功能[2]。ApoM是S1P的主要载体，并调节S1P的代谢，维持机体内皮细胞结构和功能的完整性[3]。ApoM与S1P结合具有抗炎作用[4]。加入外源性的ApoM-S1P抑制肿瘤坏死因子-α的诱导内皮细胞炎症作用[5]。作者前期研究发现，雌激素能体内外上调ApoM的表达，但具体机制尚不清楚[6]。本研究将进一步探讨雌激素调节ApoM基因转录的具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2肝癌细胞株和人乳腺癌细胞系（MCF-7）购自美国ATCC公司；DMEM培养基、无酚红DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、活性炭处理的胎牛血清和LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Gibco公司；雌二醇和牛血清清蛋白结合雌激素（E2-BSA）购自美国 Sigma公司；雌激素受体α（ER-α）拮抗剂MPP购自英国Tocris公司。质粒pGL3-basic和双荧光报告系统购自美国Promega公司；Gel Extraction Kit试剂盒和质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司的；LightShift®Chemiluminescent凝胶电泳迁移实验（EMSA）试剂盒购自美国Pierce公司；染色质免疫共沉淀（CHIP）试剂盒购自美国Thermofisher公司。总RNA提取试剂盒K352购自上海申能博彩科技有限公司。首链cDNA合成试剂盒购自立陶宛Ferments公司。引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。兔抗人ApoM多克隆抗体由瑞典隆德大学临床化学系制备。抗人单克隆抗体和辣根标记羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗购自美国Santa Cruz公司。ECL化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。总蛋白提取试剂盒购自上海炎彬化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养按常规培养HepG2细胞，用含10%活性炭处理的胎牛血清的无酚红DMEM稀释消化后离心的细胞，按5×104μL-1孔接种至6孔培养板，常规培养24 h后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3次，再加入无酚红DMEM培养基继续培养24 h，第3天PBS洗涤后，加入含不同浓度17β-雌二醇共价衍生物（E2-BSA）的无酚红DMEM培养基，继续培养24 h后，提取细胞总RNA及蛋白待测。拮抗剂试验与浓度试验与之类似，区别为第3天洗涤后，加入雌二醇（10 μmol∕L）或 E2-BSA（100 nmol∕L）及 ER-α MPP（1 μmol∕L），继续培养 24 h，提取细胞总 RNA 待测。

1.2.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量PCR RT-PCR步骤按照Ferments公司试剂盒及其说明书进行。荧光定量PCR在LightCycler荧光定量PCR仪上完成。本研究所需引物及探针见表1。反应条件为95℃3min；95℃5s，60℃15s，共40个循环；40℃1min。

1.2.3 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测ApoM的表达 将蛋白与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液混匀，置100℃5 min进行蛋白变性，冰上放置。取变性样本10 μL上样（总蛋白上样量20 μg），电泳，以250 mA电流2 h转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。含3%BSA的加吐温-20磷酸盐缓冲溶液（PBST）缓冲液中室温封闭1 h后，用ApoM多克隆抗体4℃孵育过夜，1×PBST洗膜3次后，加二抗室温孵育2 h后，采用增强化学发光法（ECL）发光检测。

1.2.4 pCDNA3.1-ER-α表达载体的构建 以人全序列基因为模板，设计含Xho I和EcoR I酶切位点的引物。从MCF-7细胞中抽提总RNA，RT-PCR扩增ER-α基因。PCR 条件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃2 min，30个循环；72℃ 10 min；16℃ 保存。1% 琼脂糖凝胶电泳分离目的基因。将ER-α回收产物和pCDNA3.1载体用限制性内切酶Xho I与EcoRI进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Gel Extraction Kit试剂盒进行产物回收。将ER-α目的基因片段和pCDNA3.1载体进行连接，并将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，接种于氨苄抗性的LB固体培养基上进行筛选。挑取单克隆，提取质粒，经Xho I和EcoRI酶切进行鉴定。鉴定正确的质粒送上海生物工程有限公司测序验证。

1.2.5 ApoM启动子区（野生型和点突变型）荧光素酶表达载体（pGL3-ApoM）的构建 （1）根据基因信息学设计预测了ApoM启动子区可能存在不同ER-α结合位点，设计了扩增引物，分别添加了BglⅡ和HindⅢ酶切位点（表2）。以全基因组为模板，PCR方法获得不同长度ApoM启动子片段。PCR条件：94℃5 min；94℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃ 10 min；16℃保存。扩增产物经双酶切后连接入pGL3-basci载体中，阳性克隆经酶切鉴定及DNA测序鉴定。（2）点突变载体的构建，设计欲定点突变的引物。正义引物：5′-TTAATAAACTCTAATATACTCACTGCCCAAATTTTGT TTGTTTTT-3′，反义引物：5′-AAAAACAAACAAAACAG TGAGTATATTAGAGTTTATTAA-3′。以构建好的ApoM P3质粒做模板，PCR扩增目的基因。PCR条件：94℃5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，18 个循环；72℃10 min；16℃保存。扩增产物经DpnI酶酶切后连接入pGL3-basci载体中，阳性克隆经酶切鉴定及DNA测序鉴定。将测序正确的重组质粒分别命名为P1、P2、P3和 P4。

1.2.6 细胞转染和双荧光素酶活性检测 （1）细胞转染：将 MCF-7按 2×104μL-1接种于24孔板，培养24 h后，用Lipofectamine 2000试剂盒进行转染。对照组pGL-3-BASIC、pcDNA3.0和pRL-SV40共转染。实验组为不同启动子区长度的pGL-3-ApoM、pcDNA3.0-ER-α和pRL-SV40共转染。（2）荧光素酶活性测定：转染48 h后，加入裂解液裂解细胞，收集上清液，并用于荧光素酶活性测定，按照试剂说明书进行操作。荧光素酶相对活性用荧光素酶活性∕海肾荧光素酶活性的比值（Luc∕RL）表示；每组同时转染3孔，进行3次独立检测，计算Luc∕RL 的平均值。

1.2.7 EMSA 利用上述构建ApoM启动子区P3位点报告基因及点突变基因为探针分析ER-α与ApoM启动子的结合活性。依照美国Pierce公司试剂盒操作说明进行，等量细胞核提取物（5 μg）与生物标记的凝胶寡核苷酸探针或冷探针在20℃以下孵育30 min，反应混合物经6.5%聚丙烯酰胺凝胶在预冷0.5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液中4℃、100 V电泳1 h。用半干电转移法转移至尼龙膜上。用封闭液室温封闭膜15 min；加放辣根过氧化物酶耦联的链亲和素，室温孵育15 min，加放化学发光底物室温孵育2 min，暗室中X射线胶片曝光。

1.2.8 染色质免疫共沉淀技术（CHIP-PCR） 按照Piece Agarose CHIP Kit试剂盒说明进行操作。选取MCF-7细胞常规培养48 h，加入终浓度1%的甲醛，37℃交联固定DNA与蛋白质10 min。收集细胞用裂解缓冲液重悬，冰上放置15 min，每5分钟涡旋混匀1次。离心取上清液，将获得的5 μL上清液作为Input组存于-80℃备用。另取45 μL加入ER-α抗体，4℃孵育过夜处理，离心收集沉淀。与Input组同时用5 mmol∕L氯化钠65℃解交联4 h，DNA纯化后溶于30 μL洗脱液中。针对ApoM上游启动子区设计特异性引物，扩增包含ER-α识别序列片段，以确定ER-α与ApoM的结合；正义引物：5′-TTGGGCAACAGAACGAGACT-3′，反义引物：5′-TATCCCATGGACTGCCACAA-3′

1.3 统计学处理 应用GraphPad 6.0统计软件进行数据分析。计量数据以表示，组间比较采用one-way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度的E2-BSA作用于HepG2细胞后ApoM mRNA和蛋白水平变化 不同浓度的E2-BSA作用于HepG2细胞24 h后，ApoM组的mRNA和蛋白水平与0 mol∕L E2-BSA比较呈浓度依赖性升高，其中100 nmol∕L的E2-BSA显著上调了ApoM的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 MPP抑制试验 MPP抑制了E2和E2-BSA对HepG2细胞中ApoM的上调作用。见图2。

2.3 ER-α基因载体构建及其重组质粒鉴定 从MCF-7细胞提取总RNA，以其逆转录反应获得的cDNA为模板，扩增ER-α。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，大约在2 000 bp的位置可见特异性目的条带，与预期结果一致。见图3 A。将PCR目的片段回收后，将pcDNA3.1空载体双酶切，经连接和转化后挑取单克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定和Xho I与Eco-RI双酶切鉴定。结果显示，在2 000 bp位置可见特异性目的条带。经测序比对，结果一致，说明ER-α基因已成功克隆至pCDNA3.1-载体上。见图3 B。

2.4 ApoM荧光素酶报告载体的构建及其重组质粒鉴定 PCR扩增ApoM启动子非编码区基因片段产物经琼脂糖凝胶电泳显示，其基因片段大小与预计相符，分别为 3 060 bp，2 207 bp、1 740 bp、1 189 bp（P1、P2、P3、P4）左右的清晰条带，表明已经获得ApoM启动子非编码基因片段。见图4 A、B。将PCR目的片段回收后，将pGL3-Basic空载体双酶切，经连接和转化后挑取单克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定和经内切酶BglⅡ与Hind Ⅲ进行双酶切。结果显示，在 3 060、2 207、1 740、1 189 bp（ApoM P1、P2、P3、P4）上相应的位置可见特异性目的条带。经测序比对，结果一致，说明ER-α基因已成功克隆至pGL3-Basic-载体上。见图4 C。

图1 E2-BSA作用于HepG2细胞对ApoM mRNA和蛋白的影响

图2 不同雌激素和MPP作用于HepG2细胞对ApoM mRNA的影响

图3 ER-α基因载体构建及重组ER-α质粒的鉴定

图4 重组ApoM质粒的构建

2.5 双荧光素酶报告系统检测ER-α对ApoM启动子活性的影响 ER-α和不同ApoM启动子片段共转染MCF-7细胞的荧光素酶实验。结果显示，ApoM启动子P3位置[-1 580～ -1 575 bp（-GGTCA）]比 P1、P2和 P4有更高的荧光素活性，而突变的P3荧光素酶活性则显著下降。这一结果说明ApoM启动子P3位置[-1 580～-1 575 bp（-GGTCA）]存在着 ER-α 结合位点。见图5。

2.6 EMSA验证ER-α与ApoM启动子序列的结合活性 只加入核蛋白作为阴性对照（图6，泳道1）。EMSA结果显示，生物素标记的探针可与核蛋白结合（图6，泳道2），而在冷竞争中复合物消失（图6，泳道3），在突变竞争中，可观察到核蛋白与DNA形成的复合物（图6，泳道4），加入抗ER-α抗体后，复合物的条带减弱，且在泳道后出现另一条复合物带（图6，泳道5）。以上结果提示ER-α与ApoM存在着相互作用。

2.7 CHIP-PCR验证ER-α与ApoM的启动子区结合采用CHIP-PCR验证细胞内ApoM启动子区存在着ER-α的结合位点。将抗ER-α抗体与裂解后的核蛋白结合，用RT-PCR对ApoM启动子P3区进行扩增。抗ER-α抗体组ApoM的表达水平是阴性对照组（IgG）的12倍，这提示内源性 ER-α直接与 ApoM启动子（-1 676、-1 519 bp）结合。见图7。

图5 双荧光酶报告系统分析ER-α对ApoM启动子活性的影响

图6 EMSA验证ER-α与ApoM启动子结合活性

图7 CHIP-PCR验证ER-α与ApoM启动子区结合

3 讨 论

作者前期研究发现，雌激素通过ER能在体内外上调ApoM的表达，但具体机制尚不清楚[6]。ER分为2大类，即经典的ER-α、ER-β及以G蛋白耦联雌激素受体为代表的膜雌激素受体。本研究结果显示，E2-BSA（不能通过细胞膜）能以剂量依赖性上调ApoM的表达，说明雌激素可以通过膜表面的ER来调节ApoM的表达，这与以前的观点相反。以前的观点认为膜表面的ER只是介导雌激素快速的非基因效应[7]。也有研究报道膜表面ER参与了基因的转录。定点突变了所有膜表面ER受体，但其他ER并不受影响。结果发现，雌激素未能调节所有组织中相应基因的表达[8]。作者通过应用MPP分别与雌激素和E2-BSA共同作用于HepG2细胞，结果发现MPP能抑制激素上调HepG2细胞ApoM mRNA效应。这意味着ER-α介导了雌激素对ApoM转录调节。ApoM是前β-高密度脂蛋白胆固醇（β-HDL）颗粒形成及成熟的必要条件[2]，ApoM还可以与S1P结合，通过S1P受体维持内皮细胞结构和功能的完整性[4-5，9]，因此，从ApoM方面也可以解释雌激素抗动脉粥样硬化的作用为了进一步探讨ER-α调节ApoM的分子机制，作者采用荧光素酶报告系统和点突变技术对ApoM启动子区可能的ER-α结合位点进行了检测，结果发现在ApoM 启动子区（-GGTCA-，-1 580～-1 575 bp）是 ApoM转录活化的基本要素，且将该区域进行点突变则消除了这一转录活性。经典的雌激素反应元件（GGTCA nnn TGACC，n代表任意碱基）是一回文结构元件，这是由13个反向重复的碱基对，和在重复序列中的3个任意替换的碱基。本研究中发现，ApoM启动子GGTCA（-1 580～-1 575 bp）是经典的雌激素反应元件的半个部分。多项研究表明，雌激素是通过非完整或一半雌激素反应元件来调节目的基因的表达，这些反应元件紧挨或远离一半回文结构[10-12]。作者应用EMSA和CHIPPCR进一步验证ER-α通过蛋白-DNA交联的方式与ApoM结合。其他核因子受体也通过与ApoM启动子区结合来调节ApoM的表达[13-14]。VENTECLEF等[14]应用DNA亲和沉淀及染色质免疫共沉淀技术证实在ApoM启动子区（-33～-21 bp）存在肝核因子-4的结合位点。已有多项研究报道，ER-α与LDL和HDL紊乱紧密联系，从而ER-α在脂代谢中的重要作用[15-17]。

本研究结果显示，雌激素通过ER-α与ApoM启动子区结合位点结合，从而上调ApoM的表达，为进一步深入研究雌激素与ApoM的抗动脉粥样硬化奠定了基础。