重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性胸腔积液的疗效及其在其中的价值

俞玲 桑琳莉 徐兴祥 许文景 杨俊俊

恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)是恶性肿瘤常见的并发症[1]，多见于晚期肺癌、乳腺癌和淋巴瘤患者，具有反复产生的特点，导致患者出现进行性加重的呼吸困难，同时可能伴有胸痛、咳嗽、厌食、烦躁不安，患者的生活质量明显下降，生存期较短[2-3]。

重组改构人肿瘤坏死因子(recombinant mutated human tumor necrosis factor, rhmTNF)是一种广谱抗肿瘤药物，已广泛应用于恶性肿瘤及恶性胸腔积液患者的治疗[4-7]。在前期临床应用及研究中我们发现多数恶性胸腔积液患者应用rhmTNF进行胸腔灌注治疗效果理想，但存在一部分患者治疗效果不理想的情况。CD133是一种公认的肿瘤干细胞标记物，在多种肿瘤组织中有表达，有研究证实CD133+细胞与肿瘤免疫逃逸、药物耐受及放化疗抵抗等机制相关[8-9]。

由于肿瘤干细胞容易对治疗不敏感，恶性胸腔积液中肿瘤细胞干性强的患者也可能对rhmTNF治疗具有不敏感性。为验证这一假说，本文通过检测治疗前胸水中肿瘤细胞的CD133表达情况，并与rhmTNF治疗恶性胸水疗效指标进行比较，旨在为筛选rhmTNF治疗优势人群提供参考。

材料和方法

一、研究对象

选取2013年1月至2014年7月扬州大学临床医学院呼吸科经病理确诊、伴有恶性胸腔积液的肿瘤患者38例作为研究对象。男性24例，女性14例，年龄38岁～82岁；肺腺癌25例，肺鳞癌6例，肺小细胞癌2例，淋巴瘤1例，乳腺癌1例，贲门腺癌1例，胃腺癌1例，前列腺癌1例。

二、治疗方案

胸腔置管闭式引流，抽尽胸腔积液后，给予rmhTN(天恩福，上海唯科生物制药有限公司)300万IU/次，生理盐水30～50 ml稀释后胸腔注射，每3 d 1次，连续给药3～4次为1个疗程。所有患者仅治疗1个疗程，治疗结束后4周评价客观疗效。38例患者中有15例患者予联合全身化疗，其余23例患者予以支持治疗。

三、肿瘤细胞及CD133+细胞的富集与鉴定

参考本课题组前期操作方法[10-11]，在无菌条件下行胸腔穿刺术抽取胸腔积液，每份样本的标准采集量为10 ml。采用人胸腔积液、腹腔积液肿瘤细胞差减富集试剂盒进行胸腔积液中的肿瘤细胞富集，采用免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交(immunostaining-FISH, iFISH)肿瘤细胞检测试剂盒及人固态肿瘤干细胞CD133免疫荧光染色试剂盒对富集到的肿瘤细胞及CD133+细胞进行染色鉴定并计数。

四、观察指标

1. 疗效判定参照世界卫生组织(WHO)恶性浆膜腔积液的评价标准: 完全缓解(complete remission, CR)，浆膜腔积液消失；部分缓解(partial remission, PR)，积液总量减少≧50%；稳定(stable disease, SD)，积液量无变化，减少<50%，或者增加<25%；进展(progressive disease, PD)，积液量增加≧25%。总有效率(overall response rate, ORR)=(CR+PR)例数/总例数×100%，疾病控制率(disease control rate, DCR)=(CR+PR+SD)例数/总例数×100%。

2. 无进展生存期(progression free survival, PFS)定义： 患者从接受治疗开始到出现肿瘤进展或死亡的时间；总生存期(overall survival, OS)的定义是指从患者从接受治疗开始至死亡的时间。

五、统计学方法

所有数据采用SPSS19.0软件分析，组间计数资料比较用χ2检验，因患者数小于40例，采用Fisher的精确检验；对无进展期(progression free survival, PFS)及总生存期(OS)评估应用生存分析Kaplan-Meier曲线法。检验水准α=0.05。

结 果

一、38例MPE患者临床特征与rmhTNF疗效的关系

38例患者中，CR病例0例，PR病例16例，SD病例18例，PD病例4例，总的ORR为42.11%。总的DCR为89.47%。患者临床特征与rmhTNF疗效的关系，见表1。因38例患者中肺腺癌25例，肺鳞癌6例，肺小细胞癌2例，淋巴瘤1例，乳腺癌1例，贲门腺癌1例，胃腺癌1例，前列腺癌1例，非肺腺癌的病例较少，在对比病理类型与rmhTNF疗效关系时，只对比了肺腺癌及非肺腺癌患者的疗效，两者的ORR及DCR无统计学差别；PS评分(0-1)的患者的DCR为100.00%，PS评分(2-3)的患者的DCR为83.33%，差别具有统计学意义；RmhTNF单药治疗的患者，ORR为26.09%，DCR为82.61%，RmhTNF联合全身化疗的患者，ORR为66.67%，DCR为100%，差别具有统计学意义。

二、38例MPE患者临床特征影响无进展期和总生存期的分析

38例患者的PFS中位数为2月，OS中位数为4月，用生存分析Kaplan-Meier曲线法对变量进行分析，发现性别、年龄、PS评分、病理类型、吸烟史对PFS及OS没有影响，但治疗方式有影响，rmhTNF单药胸腔灌注患者PFS中位数为1月，OS中位数为2月，rmhTNF胸腔灌注联合全身化疗化疗PFS中位数为5月，OS中位数为8月，两种不同治疗方式患者PFS(P<0.001)及OS(P<0.001)具有统计学差别,不同治疗方式的PFS及OS生存曲线图，见图1、图2。

图1 不同治疗方式患者的PFS生存曲线

表1 38例MPE患者临床特征与rhmTNF疗效的关系

注：aP<0.05

图2 不同治疗方式患者的OS生存曲线

三、CD133与疗效、无进展期和总生存期的关系

人胸腔积液中的肿瘤细胞经人胸腔积液、腹腔积液肿瘤细胞差减富集试剂盒进行富集后，采用免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交(immunostaining-FISH, iFISH)技术进行肿瘤细胞鉴定，荧光显微镜下可见8号染色体着丝粒探针(chromosome 8 centromere probe, CEP8)信号，且染色体信号为多倍体，见图3。胸腔积液中肿瘤细胞富集后进行CD133、CK免疫荧光染色，镜下可见CD133+CK+表达肿瘤细胞，见图4。全组患者胸腔积液中CD133+细胞数为0-7 080个/10 ml，22例患者恶性胸水中检测到CD133+肿瘤细胞，16例患者恶性胸水中未检测到CD133+肿瘤细胞。未检测到CD133+肿瘤细胞的患者应用rhmTNF治疗后MPE的ORR及DCR较检验到CD133+肿瘤细胞患者要高，未检测到CD133+肿瘤细胞的患者PFS及OS较CD133+患者长，见表2、图5、6。

图3 患者胸腔积液肿瘤细胞差减富集后iFISH染色荧光图(红色代表CEP8探针信号，蓝色代表DAPI染色细胞核)；注：A:可见细胞内有5个CEP8信号，判定为五倍体；B：可见细胞内有3个CEP8信号，判定为三倍体

图4 患者胸腔积液肿瘤细胞差减富集后CD133、CK染色荧光图(红色代表CD133表达阳性，绿色代表CK表达阳性，蓝色代表DAPI染色细胞核)；注：A中可见CD133+CK+表达肿瘤细胞；B：中分别可见CD133-CK+及CD133+CK+表达肿瘤细胞

表2 CD133表达与MPE患者疗效及预后的关系

图5 CD133+/-患者的PFS生存曲线

讨 论

肿瘤坏死因子是由巨噬细胞、单核细胞等细胞分泌的细胞因子，是目前认为最强的杀伤肿瘤细胞的因子，它通过与细胞表面TNF-α受体结合，诱导肿瘤细胞凋亡。rmhTNF和野生型TNF-α相比，敲除了N端前7个氨基酸残基，对第 8、9、10及第157位氨基酸进行了置换，改构后的rmhTNF抗肿瘤活性较野生型提高10倍，而毒副反应下降5倍,其不良反应远低于野生型TNF[12]。很多临床研究和实践观察表明，采用rmhTNF 局部灌注治疗恶性胸腔积液安全、有效。张伟京等[13]应用rmhTNF-NC注射液单药静脉输液或局部应用治疗恶性肿瘤，包括恶性淋巴瘤，恶性胸腹水，恶性黑色素瘤，肺癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌和肾癌，发现注射用rmhTNF治疗恶性淋巴瘤和恶性胸腹水疗效明确，对肺癌、恶性黑色素瘤也有一定疗效， 其中恶性胸腹水的有效率更高，提示可能与局部用药药物浓度更高有关。秦叔逵等[14]对应用rmhTNF单药腔内灌注治疗985例恶性胸、腹腔积液进行了对比分析，发现采用rmhTNF-NC单药灌注治疗恶性胸、腹腔积液有效，其安全性、耐受性好，尤其对于初治患者和恶性胸腔积液的疗效更佳。

图6 CD133+/-患者的OS生存曲线

在前期临床应用及研究中我们也发现多数恶性胸腔积液患者应用rhmTNF进行胸腔灌注治疗效果较理想，但是存在一部分患者治疗效果不理想，甚至有的患者病情恶化的情况。该类药物价格昂贵，且临床工作中应尽量避免无效的治疗，所以进一步提高对药物疗效的预测能力成为目前急需解决的问题。通过回顾性分析我们发现在治疗MPE患者时，rmhTNF联合全身化疗能取得较rmhTNF单药胸腔灌注更好的疗效和预后。患者PS评分0-1的患者较PS评分2-3分的患者在应用rmhTNF治疗MPE时能获得更好的控制率，提示在患者身体状况允许的情况下应用rmhTNF胸腔灌注联合全身化疗治疗MPE能取得更好的疗效和预后。

CD133是一种公认的肿瘤干细胞标记物，在多种肿瘤组织中有表达，有研究证实CD133+细胞与肿瘤免疫逃逸、药物耐受及放化疗抵抗等机制相关，并与多种恶性肿瘤的疗效和预后有关。Zhang 等[15]通过Meta分析得出CD133高表达的胶质母细胞瘤患者总生存期短，治疗预后差。Fathi等[16]发现CD133+的结直肠癌患者临床分期差，更易发生淋巴及远处转移，预后较差。Hashimoto 等[17]发现CD133在细胞质中的表达与胃癌的进展和预后不良有关。在肺癌方面， Mizugaki等[18]发现CD133表达与患者的临床分期相关，认为CD133+表达是非小细胞肺癌的潜在预后标志物。Wu等[19]通过系统评价和Meta分析也发现CD133表达是非小细胞肺癌的预后标志物。Kubo等[20]发现表达CD133和CD87的小细胞肺癌细胞亚群显示对化学疗法的抵抗性。在我们的研究中，发现胸水中检测到CD133+肿瘤细胞的患者应用rmhTNF治疗MPE的疗效和预后都要比未表达CD133的患者差。Hilbe 等[21]研究发现在CD133+细胞增多的非小细胞肺癌病理组织中，部分CD133+细胞排列呈管状， 指出非小细胞肺癌患者组织中的CD133+内皮祖细胞可能是促进血管生成和肿瘤生长的病因，而Stathopoulos 等[22]通过研究发现TNF-α可以激活NF-κβ途径，从而抑制肿瘤细胞凋亡，另一方面使TNF-α可上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达，VEGF是诱导血管生成的强大的促进因子，可促进肿瘤新生血管的形成，从而促进胸水的产生。由此我们推测在应用rmhTNF治疗CD133+MPE患者时，CD133+肿瘤细胞与TNF可能具有促进血管生成的协同效应，从而导致疗效及预后相对较差。

综上所述，胸水中检测出CD133+肿瘤细胞可能是应用rmhTNF治疗MPE患者的不利因素，另外在条件允许的情况下采用rmhTNF胸腔灌注联合全身化疗治疗MPE能取得较rmhTNF单药胸腔灌注更好的疗效和预后。