白藜芦醇对哮喘小鼠肺功能气道炎症的影响

姜宁 张峰 郭鲁闽 张秀荣

支气管哮喘是由多种炎性细胞及细胞组分引发的慢性气道炎症性疾病，容易引起气道上皮细胞的坏死脱落、纤毛受损，同时平滑肌细胞、杯状细胞、黏膜下腺体增生会引起气道基底膜的增厚及气道黏液分泌过多等病理表现。目前认为哮喘的主要发病机制是TH1/TH2炎症细胞因子比例失衡导致的[1]，使TH2细胞数目的相对增多和功能的亢进优势应答。内外源性过敏源诱发机体过敏反应，激活CD4+TH2细胞，而CD4+TH2细胞为主的T细胞受刺激之后活性增强，进而释放白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-5为主的TH2型炎症因子[2]。并且反过来会抑制CD4+TH1细胞释放干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)等细胞因子，导致TH1/TH2细胞比例失衡。目前糖皮质激素虽然是治疗哮喘急性发作最有效的药物，但也存在诸多不良反应。中医中药对调节TH1/TH2失衡状态有一定作用，可缓解哮喘症状。白藜芦醇(resveratrol)是一种多酚类化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫调节、抗癌、抗脂质过氧化及抗氧化应激等多种药理活性[3-5]。为探究白藜芦醇对哮喘小鼠肺功能及气道炎症的影响，本研究以卵蛋白致敏小鼠诱导哮喘模型，通过检测各组小鼠肺功能及炎性细胞因子的变化，探究白藜芦醇对哮喘小鼠肺功能及气道炎症的治疗作用。

材料与方法

一、实验材料

90只SD级6周龄Balb/c雌性小鼠(购自山东大学医学院动物饲养中心)，体质量12～20 g，按随机双盲分为对照组、哮喘组及白藜芦醇组3组，每组为30只。哮喘组和白藜芦醇组予卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏及诱导哮喘，对照组以生理盐水代替；白藜芦醇组在最后1周雾化前1 h给予白藜芦醇5 mg/kg腹腔注射。哮喘模型制备参照HONDA方法制作[6]。OVA由Sigma公司提供；ELISA试剂盒(购于武汉华美生物科技公司提供)； TRIzol总RNA提取试剂、SuperQuickRT cDNA第一链合成试剂盒(For Real-time PCR)、UltraSYBR Mixture(with ROX)购自于康为世纪公司，980超声雾化仪器(由新天缘设备公司生产 上海)；基因扩增仪；实时定量PCR仪。

二、实验方法

1. 肺功能检测： 水合氯醛麻醉小鼠，气管切开，套管针置入、固定，将小鼠放入密闭的箱子中，按指标连接管道。机械通气参数：呼吸频率为90次/min，潮气量5.6 ml/kg。呼吸压力为-8 cmH2O (1 cm=0.098 kPa)，记录跨肺压、流速，潮气量容积的变化，用计算机计算用力最大流速(peak expiratory flow, PEF)、FEV0.4/FVC时用5倍潮气量进行机械通气，-8 cmH2O负压辅助呼气，气道反应性以肺阻力(resistance of lung, RL)表示。

3. 组织处理： 处死小鼠后取出肺组织于10%中性甲醛中固定，经脱水、包埋制成蜡块并制作病理切片，HE染色观察。

4. 白细胞总数及嗜酸性粒细胞总数计数： 取小鼠内眦静脉血，收集于含有肝素钠的EP管中，用PBS稀释后涂片，进行白细胞及嗜酸性细胞计数。

5. 细胞炎性因子： 处死小鼠后小鼠气管中注入0.3%的生理盐水0.5 ml行支气管肺泡灌，共3次，并收集肺泡灌洗液，以离心半径8 cm 1 000 r/min离心10 min，收集上清保存待测。ELISA法检测气道炎症因子的浓度 。

三、统计学方法

结 果

一、各组小鼠肺组织病理学改变

对照组气道黏膜正常，肺泡壁结构完整，无黏液分泌及炎症细胞的浸润；哮喘组小鼠气道黏膜充血水肿，肺泡壁结构残缺，有大量黏液分泌，支气管壁及血管周围有大量炎症细胞浸润；白藜芦醇组小鼠黏膜水肿、肺泡壁残缺、黏液分泌及炎症细胞浸润程度均比哮喘组轻，见图1。

二、肺功能变化

哮喘组小鼠肺功能指标PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)均高于对照组小鼠PEF(12.42±0.28)、FEV0.4/FV(2.25±0.12)(P<0.05);白藜芦醇组指标PEF(9.54±0.26)、FEV0.4/FVC(1.92±0.11)则明显低于哮喘组指标PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)(P<0.05)。哮喘组气道反应性RL(2.12±0.10)高于对照组气道反应性RL(1.64±0.09)，白藜芦醇组哮气道反应性RL(1.18±0.09)低于哮喘组RL(2.12±0.10)，见图2。

三、血清中白细胞计数及嗜酸性粒细胞计数及百分比

哮喘组血清中白细胞(59.87±27.76)、嗜酸性粒细胞总数(28.24±10.82)、嗜酸性粒细胞百分比(5.04±2.84)均明显高于对照组血清中白细胞(26.83±2.14)、嗜酸性粒细胞总数(1.57±0.98)、嗜酸性粒细胞百分比(4.78±1.65)(P<0.05);白藜芦醇组血清中白细胞(35.16±17.23)、嗜酸性粒细胞总数(28.24±15.54)、嗜酸性粒细胞百分比(4.82±1.76)则明显低于哮喘组(P<0.05) ，见表1。

表1 白细胞及嗜酸性粒细胞计数

四、BALF中IL-4、IL-5及IFN-γ的表达含量

哮喘组肺泡灌洗液中IL-4(65.28±3.76)及IL-5(87.98±4.83)在蛋白水平表达均明显高于对照组IL-4(39.62±2.84)及IL-5(62.74±3.96)在蛋白水平的表达(P<0.05)；白藜芦醇组IL-4(47.19±3.13)及IL-5(72.16±3.42)在蛋白水平的表达则明显低于哮喘组(P<0.05)，哮喘组肺泡灌洗液中IFN-γ(74.26±10.82)在蛋白水平表达明显低于对照组(88.76±8.03)(P<0.05)，白藜芦醇组肺泡灌洗液中IFN-γ(82.15±9.32)在蛋白水平表达高于哮喘组(P<0.05)，见图3。

讨 论

支气管哮喘是由多种炎性细胞及炎性细胞因子参与并引起的以气道炎症、气道重塑等病理生理改变为主的慢性炎症性疾病。而气道炎症在哮喘中发挥了主导作用[7-8]。一般认为TH1/TH2平衡状态的失衡可导致TH2细胞因子分泌增多[9]，而TH1细胞在转录因子 T-bet 的作用下分化成熟，介导细胞免疫应答并且能够增强炎症细胞的细胞毒性作用，进而引起气道黏膜损伤及炎症反应激活[10]。TH2细胞在转录因子 GATA3 的作用下分化成熟，主要介导体液免疫应答并且能够促进嗜酸性粒细胞在气道内浸润，进而增加 IgE 的分泌并增加气道反应性[11]。抗原性异物感染生物体，免疫细胞通过识别、摄取等一系列免疫应答机制激活TH2细胞，T淋巴细胞合成并释放大量以IL-4、IL-13等TH2型细胞因子，这些细胞介质分泌到胞外介导Ⅱ型免疫应答[12]。另一方面，这些细胞因子能活化血管内皮黏附因子[13]，使中心粒细胞等炎性细胞趋化到组织病变部位，活化的中性粒细胞释放蛋白酶溶解周围组织，作用于血管内皮细胞导致血管通透性升高，促使大量的炎症细胞从血管内进入组织液、病变组织中[14]，并合成及分泌大量、充足的Ⅱ型细胞因子，使发病机体免疫调节功能失衡，诱发及加重支气管哮喘。支气管哮喘持续反复的发作，会加重气道气管结构的改变[15]，引起气道狭窄、气流受限，严重着肺功能会出现通气性和弥散性功能障碍，引起PEF、FEV1/FVC降低、气道反应性增高等表现。TNF-α、IFN-γ、IL-2 是 TH1合成和分泌的细胞因子，具有促炎因子的活性，能够促进单核巨噬细胞的激活并增强多种炎症细胞的细胞毒性作用[16]。

白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种天然小分子化合物，称为非黄酮类多酚化合物[17-18]，多项研究 发现其对炎症、肿瘤等多种疾病中具有良好的治疗作用，这可能与其具有抗氧化、抗炎、抑制肿瘤活性以及改善细胞内能量代谢等作用有关。Birrell等[19]证明白藜芦醇在脂多糖诱导的小鼠肺损伤中具有抗炎的作用。李玉屏[20]研究发现白藜芦醇可减轻COPD患者组织细胞内质网应激诱导的肺泡上皮细胞凋亡。而支气管哮喘本身也是多种炎性细胞及细胞组分参与的慢性炎症，基于白藜芦醇的抗炎、抗氧化等作用，本实验提出了是否其对支气管哮喘也具有一定的抗炎及改善气道重塑作用的假说。

本文结果发现对照组小鼠气道黏膜正常，肺泡壁结构完整，无黏液分泌及炎症细胞的浸润；哮喘组小鼠气道黏膜充血水肿，肺泡壁结构残缺，有大量黏液分泌，支气管壁及血管周围有大量炎症细胞浸润。气道炎症的存在加重气道的高反应性和气道重塑，导致气道痉挛及狭窄，进而引起肺功能的降低。炎症细胞因子及物质是损伤气道上皮和肺组织，引起气道上皮剥离和气道高反应的主要因素[21-23]。本实验哮喘组外周血中白细胞计数及嗜酸性粒细胞计数和所占百分比高于对照组，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼气阻力低于对照组，哮喘组BALF及肺组织中TH2型细胞因子IL-4、IL-5浓度高于对照组，而哮喘组IFN-γ的浓度低于对照组，表明多种炎性细胞及炎性细胞组分的失衡参与了哮喘的发生及发展。

糖皮质激素在哮喘的急性发作期是最有效的缓解药物[24]，主要作用机制在于抑制细胞炎性因子的合成及释放，阻止炎症细胞的趋化等，但用药时间长，产生的副作用较多[25-26]。近年来，中药治疗哮喘逐渐成为研究热点，然而中药制剂中有效成分、作用方式等具体机制尚不明确。哮喘的发病与多种炎性介质、细胞因子及炎性细胞的活动有关。因此从调整机体免疫功能及抗炎症因子的释放的途径来治疗哮喘，成为选择中药治疗哮喘方向。本实验通过选取具有抗炎及具有免疫调节作用的中药白藜芦醇，白藜芦醇是一种多酚类化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫调节、抗癌、抗脂质过氧化及抗氧化应激等多种药理活性。本文中给予诱导哮喘的小鼠白藜芦醇腹腔注射，发现白藜芦醇组外周血中白细胞计数及嗜酸性粒细胞计数和所占百分比较哮喘组明显减低，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼气阻力比哮喘组明显提高；白藜芦醇组BALF及肺组织中TH2型细胞因子IL-4、IL-5浓度低于哮喘组，而TH1型细胞因子IFN-γ浓度高于哮喘组，说明白藜芦醇可能通过维持TH1/TH2细胞因子的平衡及提高免疫功能抑制TH2型炎性因子的合成，而促进TH1型炎性因子的合成与释放，从而起到治疗作用。

综上所述，本实验结果显示中药白藜芦醇能够抑制TH2型炎性因子IL-4、IL-5的合成，而促进TH1型炎性因子IFN-γ的合成与释放，维持TH1/TH2的平衡及提高免疫功能，改善肺功能。为支气管哮喘治疗提供了新措施。