KKAy小鼠聚合酶delta作用蛋白2缺乏导致血糖异常的研究

岳萍萍，陈可洋，孔德润

根据国际糖尿病联合会的统计，2015年全球每11个成年人中就有1个患有糖尿病。肝脏是控制葡萄糖水平的主要靶器官之一，通过调节摄取和储存过程以及葡萄糖的输出来维持葡萄糖稳态。在肥胖和糖尿病动物中存在“选择性胰岛素抵抗”，胰岛素不能抑制肝脏糖异生却可以激活脂肪的生成，导致糖脂代谢的紊乱。在肝脏中存在一个重要的调控机制就是对胰岛素受体(insulin receptor，IR)、胰岛素受体底物(insulin recetor substrate,IRS) 以及其他下游分子的蛋白质酪氨酸磷酸化进行的可逆调节。其中有一个经典的信号传导通路就是通过胰岛素/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)传导通路来调节糖脂代谢。另一方面，IR可刺激NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)产生过氧化物自由基，之后抑制下游的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN),而这种蛋白是胰岛素信号转导的主要负调控因子[1]。聚合酶delta作用蛋白2(polymerase delta-interacting protein 2,Poldip2)做为NOX4的积极监管机构，能通过稳定NOX4/p22phox复合物或增加应力纤维的结合位点来增强NOX4的活性，增加其氧化的功能[2]。该研究提出假设在2型糖尿病小鼠中可能由于Poldip2的缺乏，导致下调了活性氧(reactive oxygen spcies,ROS)减少过氧化氢(H2O2)的生成，大量的PTEN产生对胰岛素信号通路起到负性调节的作用，从而改变了胰岛素信号通路中的下游蛋白及产生糖代谢的紊乱。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂SPF级的7周雄性KKAy模型鼠45只(体质量30～40 g)，以及7周C57BL/6J雄性小鼠12只(体质量25～30 g)均购自北京华阜康生科技有限公司。H2O2试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂购自美国Thermofisher公司；逆转录反应试剂RR037A、RT-PCR专用试剂RR820A均购自大连TaKaRa公司；引物购自上海捷瑞生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液(强)购自江苏碧云天生物技术有限公司；Western blot 一抗β-actin 购自美国Sigma公司；Poldip2 购自美国Santa Cruz公司；NOX4、PTEN、磷酸化的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源(phospho-phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，p-PTEN)、磷酸化的AKT丝氨酸473位点(phospho-Akt ser473,p-Akt 473)、磷酸化的AKT苏氨酸308位点(phospho-Akt thr308,p-Akt308)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)均购自美国cell signling technology公司；Akt、Forkhead转录因子1(Forkhead box protein O1，FoxO1)、磷酸化的Forkhead转录因子1(phospho-Forkhead box protein O1，p-FoxO1) 均购自美国abcam公司；葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)购自美国Thermofisher公司；Western blot二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2动物处理小鼠安置于安徽医科大学动物中心，温度控制在20～25 ℃，湿度控制在(50±5)%，维持室内光照12 h/12 h。C57BL/6J小鼠喂养用普通基础饲料，KKAy小鼠的喂养配合高脂饲料。动物被允许自由获取食物和水。将45只KKAy小鼠经过4周喂养后，随机分成3组。GFP组(通过尾静脉给予空载体GFP腺病毒4×1010Vp/鼠，n=16)；PBS组(通过尾静脉注射等量的磷酸盐缓冲盐水，n=11)；Poldip2组(通过尾静脉给予过表达Poldip2腺病毒5×1010Vp/鼠，n=18)。C57BL/6J小鼠尾静脉注射等量的磷酸盐缓冲盐水(n= 12)作为正常对照组。 因在小鼠肝脏中腺病毒2～3 d达到最高峰，5 d后变化减少,故在第4天各组再追加注射1次，注射的方式以及剂量同前。各个组每周注射2次相应试剂，注射一周，小鼠空腹8 h，测量体质量以及空腹血糖。先通过眼球取血的方式获取血清。之后每个小鼠按60 mg/kg体质量腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉，用生理盐水胸腔灌注，待肝脏颜色变白后停止，取出肝脏。用1～2 g新鲜肝脏检测H2O2，其余肝脏立即在液氮中快速冷冻并在-80 ℃下储存。

1.3H2O2的检测取新鲜肝脏在冰上操作按照每毫克加入20 ml裂解液，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，留取上清液按照说明书操作。

1.4Westernblot用RIPA裂解液提取各组肝脏中组织总蛋白，采用BCA浓度测定试剂盒进行蛋白定量。之后每个样品孔上10～20 μg蛋白。在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质样品并转移到PVDF(0.2 μm)膜上；之后PVDF膜用TBST(Tween-20 / TBS)配的5%脱脂牛奶室温下封闭2 h；接着0.1%TBST(Tween-20/TBS)洗膜10 min；之后的膜与β-actin、Akt、p-Akt473、p-Akt308、PTEN、p-PTEN、FoxO1、p-FoxO1、PEPCK、NOX4、Poldip2和G6Pase等相应的一抗于4 ℃孵育过夜。膜再次用0.1% TBST(Tween-20/TBS)洗涤3次，每次10 min。洗涤后，将膜与二抗在室温孵育约2 h。

1.5RT-PCR反应根据TRIzol试剂说明书,从100 mg冷冻肝中提取总RNA。总RNA的浓度通过微量分光光度计在260 nm和280 nm测量。然后严格按照说明书进行RT-PCR,测得Ct值。 以β-actin作为内参照，用2-ΔΔCt法分析相关基因的表达。 PEPCK正向引物:5′-CTGGCACCTCAGTGAAGACA-3′,反向引物:5′-TCGATGCCTTCCCAGTAAAC-3′；G6Pase正向引物:5′-TTCTGGATGGTTCCCTGAAG-3′,反向引物:5′-ACCGCAAGAGCATTCTCAGT-3′;β-actin正向引物:5′-CTCTCCCTCACGCCATC-3′,反向引物:5′-ACGCACGATTTCCCTCTC-3′。

2 结果

2.1体质量及血糖检测经过4周的喂养后，KKAy小鼠的体质量为(36.34±1.05)g，与正常对照组C57BL/6J小鼠的体质量(28.91±0.72)g比较，KKAy小鼠体质量增加明显，差异有统计学意义(P<0.05)；KKAy小鼠的空腹血糖水平为(9.57±0.47)mmol/L,与正常对照组C57BL/6J小鼠的空腹血糖(6.41±0.20)mmol/L比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。之后根据处理不同分为4组进行干预1周，各组在干预1周后体质量均未见明显变化。Poldip2组干预前空腹血糖水平为(9.78±0.29)mmol/L，干预后血糖为(8.64±0.28)mmol/L，两者差异具有统计学意义(P<0.05),说明Poldip2可改善KKAy的血糖水平。

2.2肝脏H2O2的检测小鼠新鲜肝脏中测H2O2，4组之间的H2O2水平差异有统计学意义(F=95.17，P<0.05)。与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，PBS组和GFP组的水平显著降低(P<0.05)，而Poidip2组则无明显变化。见图1。

图1 新鲜的肝脏中H2O2的水平

1：正常对照组；2：PBS组；3：GFP组；4：Poldip2组；与正常对照组比较：*P<0.05

图2 4组小鼠的Poldip2、NOX4、PTEN及p-PTEN 的蛋白表达变化

A:肝脏中Poldip2、NOX4的表达;B:肝脏中PTEN及p-PTEN的表达； 1：正常对照组；2：PBS组；3：GFP组；4：Poldip2组；与正常对照组比较：*P<0.05

2.3Poldip2对于胰岛素信号通路中蛋白表达的影响

2.3.1肝脏中Poldip2、NOX4、PTEN及p-PTEN的表达 与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，KKAy小鼠中的PBS组和GFP组Poldip2、NOX4的蛋白表达被显著抑制(P<0.05)；而与PBS组、GFP组比较，Poldip2组的Poldip2、NOX4表达水平明显上升(P<0.05)。与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，PBS组和GFP组PTEN与p-PTEN的比值显着降低(P<0.05)。与PBS组、GFP组比较，Poldip2组中PTEN与p-PTEN的比值升高至正常水平。见图2。

2.3.2肝脏组织中Akt、FoxO1及p-FoxO1的表达 与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，其余3组中总Akt蛋白表达水平无明显变化，但PBS组和GFP组中的p-Akt473和p-Akt308表达显著降低(P<0.05),Poldip2组的p-Akt473和p-Akt308则上升至正常水平。PBS组和GFP组的FoxO1和p-FoxO1的比值显着高于正常对照组C57BL/6J小鼠(P<0.05)，但Poldip2组的比值则无明显变化。见图3。

2.3.3肝脏组织中G6Pase及PEPCK的表达 与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，PBS组和GFP组中的表达显着升高(P<0.05)。而与PBS组、GFP组比较，Poldip2组中的PEPCK和G6Pase显著降低(P<0.05)。见图4。

2.4肝脏组织中G6Pase、PEPCK的mRNA表达水平通过RT-PCR来了解这4组肝脏中PEPCK和G6Pase的mRNA表达。 结果显示，与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，PBS组和GFP组PEPCK和G6Pase mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，但Poldip2组的 mRNA表达水平却无明显变化，与PBS组和GFP组比较，Poldip2组的PEPCK和G6Pase mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。这与Western blot的结果一致。见图5。

3 讨论

Poldip2是与人DNA聚合酶delta和增殖细胞核抗原的小亚基p50相互作用的。研究[3]表明Poldip2与DNA复制和修复，线粒体功能和延伸以及细胞黏附受体的下游信号有关。在目前的研究中，国内外对于Poldip2大多与NOX4相联系，而对于代谢性疾病如糖尿病的研究甚少。本研究结果表明提高糖尿病小鼠的Poldip2可明显改善血糖水平，从而提示Poldip2可能成为治疗糖尿病的一个新靶点。

肝脏中有多个细胞信号传导通路参与血糖的调节。其中有比较经典的胰岛素/PI3K/Akt信号传导通路。在正常生理状态下，胰岛素与其受体结合发生自动磷酸化，激活细胞内IRS家族磷酸化。继而激活PI3K，导致3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)的产生[4]。 此时位于Akt激酶上的苏氨酸308位点被磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1磷酸化。同时Akt上的丝氨酸473位点也发生磷酸化，从而完全催化激活Akt[5]。激活的Akt调节其下游蛋白质，其中有FoxO1[6]。FoxO1被磷酸化后活性下降，从而导致下游的糖异生关键酶活性降低，阻断糖异生途径[4,7]。IR同时可刺激NOX4抑制PTEN， 其抑制机制依赖于半胱氨酸的氧化[8]。 即Poldip2功能的丧失会抑制NOX4活性，从而导致过氧化物减少，导致下游的PTEN增加，PTEN通过去磷酸化Akt，降低其活性，对胰岛素信号传导途径的上游成分起到负面影响[9]，从而影响胰岛素信号的传导。

图3 4组小鼠的Akt、FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达变化

A:肝脏组织中Akt的表达;B:肝脏组织中FoxO1及p-FoxO1的表达1：正常对照组；2：PBS组；3：GFP组；4：Poldip2组；与正常对照组比较：*P<0.05

图4 4组小鼠G6Pase、PEPCK蛋白表达变化

A:G6Pase;B:PEPCK; 1：正常对照组；2：PBS组；3：GFP组；4：Poldip2组；与正常对照组比较：*P<0.05

图5 4组小鼠G6Pase、PEPCK mRNA表达的变化

A:G6Pase mRNA;B:PEPCK mRNA; 1：正常对照组；2：PBS组；3：GFP组；4：Poldip2组；与正常对照组比较：*P<0.05

实验结果表明，与正常对照组C57BL/6J小鼠比较，KKAy小鼠H2O2水平显著下降，而注射Poldip2腺病毒后，KKAy小鼠的H2O2水平得到了明显上升。同时PBS组和GFP组的NOX4、Poldip2、PTEN、p-Akt473、p-Akt308、p-FoxO1蛋白的表达水平较正常对照组下降，但p-PTEN、FoxO1、PEPCK、G6Pase较正常对照组上升。Poidip2组的结果表明NOX4、 Poldip2、PTEN、p-Akt473、p-Akt308、p-FoxO1蛋白的表达水平较PBS组、GFP组上升，但p-PTEN、FoxO1、PEPCK、G6Pase较PBS组和GFP组下降。表明Poldip2可能抑制PTEN从而增强Akt活性。即通过PTEN/Akt/FoxO1通路下调PEPCK和G6Pase活性减少糖异生，从而改善糖代谢成为胰岛素信号通路的一个正调节因素。综上所述，Poldip2能够改善2型糖尿病鼠的糖代谢机制可能是通过升高Poldip2的表达，激活NOX4产生H2O2，抑制了PTEN活性，从而提高Akt活性，达到改善胰岛素信号通路及糖代谢的紊乱的效果。