养血解毒汤对银屑病模型小鼠JAKs-STAT信号通路及炎性因子的影响

肖卫棉 查旭山

(肇庆市皮肤病医院皮肤科，广东 肇庆 526020)

银屑病是慢性炎症增生性疾病，是皮肤科多发病、常见病，容易反复发作，是皮肤科难治病之一，属于自身免疫性疾病，以红斑鳞屑为主要临床表现，主要特点为角质形成细胞异常分化和过度增殖〔1,2〕。养血解毒汤在银屑病的治疗上效果显著〔3〕，但其机制尚不十分清楚。本文选择昆明小鼠雌激素期增生的阴道上皮模型和尾鳞片表皮模型，观察养血解毒汤对银屑病的干预作用及对Janus激酶(JAKs)-信号转导子与转录激活子(STAT)信号通路及炎性因子的影响。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：雌性、体重20～24 g、昆明种小鼠24只，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2015-0004。

药物：养血解毒汤所含药物土茯苓、当归、鸡血藤、玄参、草河车、麦冬、生地、车前子、板蓝根、丹参等由该院中药房提供，制剂室按成人剂量换算成小鼠用量，制成水煎剂，质量控制由制剂室负责。甲氨蝶呤片(厂家：江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32024655，批准日期：2015-09-02，规格2.5 mg)，戊酸雌二醇片(厂家：北京协和药厂，国药准字H20000031，批准日期：2010-12-17，规格：0.5 mg)。

主要试剂：二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(美国Abcam公司)，兔抗人STAT3单克隆抗体、兔抗人磷酸化(P)-STAT3单克隆抗体、兔抗人STAT5单克隆抗体、兔抗人P-STAT5单克隆抗体，TRIzol总RNA提取试剂(美国Sigma公司)等。

1.2方法

1.2.1模型建立 雌激素周期小鼠阴道上皮模型：实验开始前3 d给予昆明小鼠戊酸雌二醇(每天1次，每次10 mg/ml)灌胃，使阴道上皮处于雌激素期从而模拟昆明小鼠表皮增生过快特点。尾部鳞片表皮模型：昆明小鼠尾部鳞片表皮正常角化，没有颗粒层形成，可直接模拟银屑病角化不全、分化障碍的特点。

1.2.2小鼠分组及处理 将24只昆明小鼠根据随机数字法分为生理盐水组、养血解毒汤组、甲氨蝶呤组，每组8只。养血解毒汤组小鼠每天给予养血解毒汤水煎剂(0.2 ml)灌胃，甲氨蝶呤组小鼠每天给予甲氨蝶呤片水溶液(0.2 ml)灌胃，生理盐水组每天给予等量生理盐水灌胃，共6 d。

1.2.3各组小鼠阴道上皮有丝分裂指数测定 治疗结束次日清晨9点脱臼处死小鼠，取阴道组织用甲醛固定、石蜡包埋、常规HE染色，显微镜下观察小鼠阴道上皮有丝分裂的基底细胞，计算阴道上皮有丝分裂指数，阴道上皮有丝分裂指数为每100个基底细胞中有丝分裂细胞个数。

1.2.4各组小鼠尾部颗粒层片数测定 取小鼠尾部皮肤用甲醛固定、石蜡包埋、常规HE染色，显微镜下观察小鼠的尾部鳞片数，有颗粒层形成的鳞片为鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞，尾部颗粒层片数为每100个鳞片中有颗粒层的鳞片数。

1.2.5小鼠阴道上皮和尾部组织中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表达测定 将小鼠阴道上皮和尾部组织切片脱蜡至水，采用免疫组化法测定组织中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表达，将各组小鼠的免疫组化图像经Image-Pro Plus软件分析得出阴道上皮和尾部组织中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5的光密度值。

1.2.6小鼠阴道上皮和尾部组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、干扰素(INF)-γ mRNA测定 将各组小鼠阴道上皮组织和尾部组织研磨后，提取总RNA，测定RNA的含量和纯度，选取RNA完整、无污染的总RNA进行逆转录为cDNA，采用RT-PCR测定阴道上皮和尾部组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表达，PCR扩增条件为95℃ 30 s；95℃ 5 s、55℃ 5 s共39个循环；65℃ 5 s、95℃ 10 s。以2-ΔΔCt作为TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ基因的相对表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件，计量资料采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1各组阴道上皮有丝分裂指数比较 三组小鼠阴道上皮有丝分裂指数比较差异有统计学意义(F=42.001，P=0.000)，其中养血解毒汤组(13.29±2.21)和甲氨蝶呤组(12.58±1.87)小鼠阴道上皮有丝分裂指数均低于生理盐水组(30.03±4.59，P<0.05)，养血解毒汤组和甲氨蝶呤组小鼠阴道上皮有丝分裂指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组小鼠尾部颗粒层片数比较 三组小鼠尾部颗粒层片数比较差异有统计学意义(F=7.082，P=0.000)，其中养血解毒汤组(12.28±1.11)和甲氨蝶呤组(13.19±1.23)小鼠尾部颗粒层片数高于生理盐水组(7.76±1.02，P<0.05)，养血解毒汤组和甲氨蝶呤组小鼠尾部颗粒层片数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表达比较 三组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中STAT3和STAT5光密度值差异无统计学意义(P>0.05)，P-STAT3和P-STAT5光密度值差异有统计学意义(P<0.05)，其中养血解毒汤组和甲氨蝶呤组P-STAT3、P-STAT5光密度值低于生理盐水组(P<0.05)，养血解毒汤组和甲氨蝶呤组P-STAT3、P-STAT5光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5颗粒光密度值比较

与生理盐水组比较:1)P<0.05；下表同

2.4各组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA比较 三组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差异有统计学意义(P<0.05)，其中养血解毒汤组和甲氨蝶呤组TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA低于生理盐水组(P<0.05)，养血解毒汤组和甲氨蝶呤组阴道上皮中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠阴道上皮及尾部皮肤中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA水平比较

3 讨 论

银屑病与多基因遗传关系密切，病灶内异常T淋巴细胞浸润为银屑病发生的中心环节，异常活化的T细胞可分泌多种细胞因子，细胞因子通过JAKs/STATs等多条信号通路，参与角质形成细胞的异常分化、过度角化、血管异常增生等多种病理过程，因此JAKs/STATs信号通路在银屑病的免疫反应和炎症反应及细胞信号传递中发挥重要作用〔4，5〕。

STAT是JAKs的作用底物，是一种独特的蛋白家族，能够与DNA结合。STAT包含7个家族成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，STATs在未激活细胞中存在于细胞质中,当促红细胞生成素、集落刺激因子、干扰素等因子和受体结合后，引起受体二聚化，相应受体的二聚化使JAKs发生磷酸化而被活化，磷酸化的JAKs使相连受体的酪氨酸残基磷酸化，酪氨酸残基的磷酸化使酪氨酸位点暴露，并与氨基酸序列结合，把含有SH2结构域的STATs吸引到酪氨酸位点处，JAKs引起与受体相连的STATs磷酸化，磷酸化的STATs从受体脱落，形成二聚体，活化的STATs二聚体进入细胞核，和目标启动子区域结合，影响基因的转录、表达〔6，7〕。

银屑病为一种T细胞异常表达的免疫性疾病，在银屑病的发病过程中，T细胞局部活化发挥重要作用〔8，9〕，活化的T细胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等一系列细胞因子，分泌的上述细胞因子刺激邻近的内皮细胞、单核巨噬细胞、角质形成细胞等通过旁分泌或者自分泌的方式分泌大量细胞因子，使多种细胞因子发生级联放大反应；各细胞因子之间相互调节，形成复杂的细胞因子网络〔10，11〕。

养血解毒汤的君药为鸡血藤和土茯苓，鸡血藤具有养血作用，土茯苓具有解毒作用，佐以当归、丹参、草河车、板蓝根、玄参，当归和丹参具有养血润肤作用，草河车、板蓝根、玄参具有祛湿解毒作用，体现了养血解毒汤的养血活血、祛湿解毒的治疗原则〔12〕，在银屑病的治疗中效果显著〔13〕。本文结果发现，养血解毒汤可降低小鼠阴道上皮有丝分裂指数，升高尾部颗粒层片数，降低小鼠阴道上皮和尾部皮肤中P-STAT3、P-STAT5表达及阴道上皮和尾部皮肤中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表达，其作用效果与甲氨蝶呤类似。可见，养血解毒汤对银屑病具有治疗作用，其机制可能与养血解毒汤可抑制上皮细胞有丝分裂、促进表皮颗粒层生成、抑制STAT3和STAT5磷酸化，减少炎性因子水平有关。银屑病患者体内存在免疫平衡失调，TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等炎性细胞因子分泌异常，炎性因子的异常分泌作为细胞外刺激信号激活角质形成细胞上的JAKs激酶，引起JAKs发生自身磷酸化，募集细胞内的STATs形成二聚体，STATs二聚体进入细胞核与相关基因结合，对T细胞分化、毛细血管增生、角质形成细胞异常增殖等过程发挥调控作用，从而引起银屑病的发生发展〔14，15〕。