Wnt7a及其受体Fzd5在大肠癌中的表达及意义

孙 丹 王淑坤 苗玉娟 卢 强 侯 琛 宋 妍 周风华

(潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊 261053)

目前大肠癌的治疗手段主要包括外科手术治疗、化学药物治疗及放射治疗〔1，2〕，虽然治疗手段不断提高，但是由于治疗后的高复发率及远处器官的转移，导致大肠癌对人类健康仍然存在严重威胁〔3〕。Wnt基因编码分泌型糖蛋白，主要通过与Frizzled(Fzd)受体结合参与细胞的增殖、分化及肿瘤生长等多种生物学过程〔4〕。Wnt7a属于Wnt家族中的经典Wnt信号分子，通过经典的Wnt/β-catenin信号过程参与多种恶性肿瘤的发生发展〔5〕。本研究从受体与配体结合的角度，研究Wnt7a及受体Fzd5在大肠癌组织中的表达变化，探讨Wnt7a及受体Fzd5在大肠癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1材料 收集潍坊医学院附属医院病理科2015年1月至2016年12月结肠癌手术切除标本80例，男45例，女35例，年龄26～82(平均62)岁；以癌旁正常组织作为对照，切取石蜡切片用于HE染色及免疫组化染色。取10例新鲜肿瘤及瘤旁正常组织，放入液氮，用于提取RNA和蛋白，进行qRT-PCR及Western印迹检测。患者术前均未接受化疗及放疗。

1.2主要试剂 小鼠单克隆抗体Wnt7a购自Santa Cruz (sc-365459)，兔多克隆抗体Fzd5购自Novus biologicals(IMG-71276)。二步法免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中山生物试剂有限公司。

1.3免疫组化及判读标准 主要步骤：切取石蜡切片，厚5 μm，常规脱蜡入水，过氧化氢(H2O2)封闭内源性过氧化物酶，微波抗原修复，滴加一抗(Wnt7a及Fzd5浓度均为1∶100)，4℃过夜，二抗及DAB显色，以出现棕黄色颗粒为阳性表达，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。判读标准：根据肿瘤细胞阳性着色比例和着色强度判定，阳性着色比例指阳性染色细胞占5个以上高倍镜视野(400倍)同类细胞的百分比，阳性细胞<5% 为0分，≥5%且<25% 为1分，≥25%且<50%为2分，≥50%且<75%为3分，≥75%为4分;细胞着色强度计分：0分为细胞无着色，1分为淡黄色，2分为黄色、棕黄色，3分为棕褐色。将两项得分结果相加：0～1分为阴性，2～7分为阳性。

1.4qRT-PCR 用Trizol提取组织总RNA并反转录合成cDNA，Wnt7a/Fzd5的PCR体系包括：SYBR Premix (SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ kit，Takara，大连)10 μl，Wnt7a/Fzd5上、下游引物分别为0.5 μl，cDNA 1 μl，去离子水8 μl。以β-actin作为内参照，体系配制包括：SYBR Premix 10 μl，β-actin上、下游引物各0.3 μl，去离子水8.4 μl。引物由上海生物工程有限公司设计并合成，引物信息见表1。在荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TM Real-Time System)中进行扩增。Wnt7a及Fzd5的相对表达量通过检测相对循环阈值(2-ΔΔCt) 来获得。

表1 qRT-PCR引物信息表

1.5Western印迹 提取组织总蛋白，并在酶标仪中测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为2 μg/μl，并将蛋白变性。常规进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量的蛋白，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分别孵育一抗Wnt7a及Fzd5(浓度分别为1∶1 000)，4℃过夜。分别在辣根过氧化物酶标记的抗小鼠及抗兔的二抗中孵育，电化学发光法(ECL)进行发光。

1.6统计学分析 使用Prism5.01软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。组间数据比较采用单因素方差分析，Wnt7a及Fzd5之间的相关性及与大肠癌临床病理参数之间的相关性采用Spearman分析。

2 结 果

2.1Wnt7a在大肠癌组织及癌旁正常组织的表达 免疫组化结果显示，Wnt7a的阳性表达呈棕黄色颗粒状，主要表达于细胞质。肿瘤组织内Wnt7a阳性表达率为82%，明显高于癌旁正常组织35%，差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR及Western印迹结果显示，与正常肠黏膜(1.267±0.203，0.250±0.066)相比，肿瘤组织内Wnt7a在mRNA(2.574±0.487)及蛋白(0.750±0.250)水平均明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1，图2。

2.2Fzd5在大肠癌组织及癌旁正常组织的表达 免疫组化结果显示，Fzd5的阳性表达呈棕黄色颗粒状，主要表达于细胞质。肿瘤组织Fzd5的阳性表达率为87%，明显高于癌旁正常组织的41%，差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR及Western印迹结果显示，与正常肠黏膜(1.353±0.238，0.412±0.491)相比，肿瘤组织内Fzd5 mRNA(2.694±0.463)及蛋白(0.869±0.156)水平均明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1，图2。

图1 Wnt7a、Fzd5在大肠癌及正常肠黏膜中的表达(免疫组化，Bar=25 μm)

图2 Western印迹检测Wnt7a、Fzd5在大肠癌及正常肠黏膜中的表达

2.3大肠癌中Wnt7a及Fzd5的表达与临床病理参数的关系 Wnt7a及Fzd5的表达与患者的年龄、性别、分化程度无关，差异无统计学意义(P>0.05)，与肿瘤大小、Duke分期及淋巴结转移有关，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 大肠癌组织中Wnt7a与Fzd5表达与临床病理参数的关系

2.4大肠癌中Wnt7a及Fzd5表达的相关性 大肠癌组织内Wnt7a及Fzd5的表达呈明显的正相关(r=0.712，P<0.05)。

3 讨 论

Wnt信号通路在胚胎发育及肿瘤发生发展中发挥重要作用〔6〕。Wnt信号的起始为Wnt配体与靶细胞上的特异性受体结合，引起信号的传递，导致靶细胞发生一系列生理反应或病理变化。Wnt配体通过与不同受体的结合介导不同的效应过程〔7，8〕。Fzd受体，由Frizzled基因编码，属于7次跨膜蛋白受体家族。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上的Fzd受体结合，激活细胞内信号转导分子，调节靶基因的表达，参与正常胚胎发育和各种疾病过程。研究发现，多种Wnt信号分子与肿瘤的发生发展有关〔9，10〕。Wnt7a是一种分子量约39 kD的糖蛋白，是Wnt信号家族中的一员，在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔11〕。在乳腺癌，Wnt7a的表达与结缔组织及患者预后不良有关〔12〕；也有研究表明，Wnt7a的活化抑制了肺癌及白血病细胞的增殖〔11〕；Wnt7a与受体Fzd9的相互作用抑制了非小细胞肺癌细胞的转化生长，促进了细胞的分化〔13〕；有研究发现，Wnt7a可能会促进大肠癌发生发展，但具体机制尚未明确。

本实验结果提示，Wnt7a在大肠癌中的作用可能通过与受体Fzd5的结合从而介导Wnt信号的传导有关。Wnt7a的受体可能存在多种，譬如Fzd9、ROR1/2〔13〕等，而Wnt信号与不同受体的结合可能会介导不同的生物学效应。在大肠癌的发生发展中，Wnt7a是否与其他受体结合及作用将是下一步研究的重点，而Wnt7a与不同受体结合有可能成为大肠癌治疗的潜在靶点。