广州地区女性人乳头状瘤病毒感染的检测及其亚型流行病学调查

陈 波 黄海樱 周 强 嘉红云 冀天星 王敏红 范 平 陈靖楠

(广州医科大学附属第二医院检验科，广东 广州 510260)

Laverty在1977年通过电镜观察到人乳头状瘤病毒(HPV)存在宫颈癌组织里，目前研究表明导致宫颈癌的直接病因是存在HPV感染〔1～3〕。HPV有多种不同基因型(亚型)，已确定亚型有超过120种，其中约40种涉及人类的生殖道感染。不同HPV亚型对宫颈上皮细胞的侵袭力不同，其中已确认HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68等亚型主要是跟宫颈癌和宫颈上皮内瘤变有相关，可视其为高危型。HPV11、16、42、43和44 等亚型与尖锐湿疣等外生殖器良性病变有关，为低危型〔4〕。高危型HPV的长期持续感染是宫颈癌变的主要原因，因此，研制开发针对高危型HPV型特异性基因疫苗是宫颈癌的治疗新方向，使该病成为目前唯一的一种病因明确的，又可以治愈和提前预防的恶性肿瘤。由于HPV亚型的多样性和不同地区的感染亚型差别不一，造成针对HPV16和HPV18亚型的疫苗仅能有效保护约70%患者。世界癌症组织的多中心研究数据显示，包含7种最常见HPV亚型复合型的疫苗可以保护世界上多达87%的患者〔2～4〕。本研究利用核酸分子快速杂交分型技术对门诊高危人群生殖道HPV感染状况，进行筛查，进行流行病学调查和分析。

1 资料和方法

1.1研究对象 标本来源广州医科大学附属第二医院2011～2013年妇科门诊和体检中心检查妇女2 912名。年龄18～81岁，平均(37.50±10.48)岁。

1.2仪器和试剂 凯普公司生产HPV的DNA分离提取试剂盒(细胞裂解液)。ABI 7700型PCR扩增仪由美国ABI公司生产。HPV基因分型检测试剂盒由凯普公司生产。HybriMax医用核酸分子快速杂交仪由凯普公司提供。

1.3标本采集和保存处理 按照宫颈细胞学取材要求和步骤进行HPV筛查标本取样，将宫颈刷放置于宫颈口处，手指轻轻转动宫颈刷5圈，使其顺时针方向旋转，慢慢取出宫颈刷，把采集到标本放置在已加有专用细胞保存液的取样管中，拧紧瓶盖，立刻送实验室检查，或4℃保存待检(存放2 w)，或-20℃长期保存。

1.4HPV分型检测步骤 (1)HPV DNA分离提取。(2)HPV PCR扩增。(3)核酸分子杂交。(4)显色(检测结果阳性为蓝紫色圆点)。(5)结果读取。Biotin(酶和显色对照)和IC(内对照)点为阳性，其他点为阴性，判定HPV分型DNA检测结果为阴性；Biotin(酶和显色对照)和IC(内对照)点为阳性，其他有一个或多个点为阳性，相应判定HPV分型DNA检测结果为阳性(单个或多个HPV感染)。试剂盒检测21种HPV病毒DNA分型，分为高危型和低危型两类，高危型12种亚型，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58和59，低危型5种亚型，包括HPV6、11、42、43和44，中国人常见亚型分别为HPV53和CP8304。

1.5统计方法 使用SPSS17.0软件进行χ2检验及分割检验。

2 结 果

2.1HPV感染的年龄分布 按年龄分为18～20、21～25、26～30、31～35、36～40、41～45、46～50、51～55、56～60、61～65和66～81岁11组，HPV筛查人群年龄高峰在36～40岁，其次为31～35岁，66～81岁HPV筛查人群最低，其次为18～20岁。HPV感染率有3个峰值，分别是21～25岁、46～50岁和66～81岁，呈波浪变化。感染人群高峰年龄出现晚，但下降快。各年龄段HPV感染检出率差异无统计学意义(χ2=7.300，P>0.05)。见表1。

表1 各年龄段HPV例数、阳性数和阳性率(%)

2.2HPV感染的亚型分布 HPV亚型总阳性率39.22%(1 142/2 912，包括多重感染，重复计算)，21种亚型均被检出。感染率最高是HPV16，其次是HPV52、HPV58和CP8304，最低是HPV43，其次是HPV35，见表2。

表2 HPV感染亚型的例数、阳性数、阳性率和构成比(%)

与HPV43比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与HPV51、56、59、45、42、44和35比较：3)P<0.01；与HPV33、53、18、68、6、31、66和39比较：4)P<0.01；与HPV11比较：5)P<0.01；与CP8304比较：6)P<0.01；与HPV58比较：7)P<0.01

筛查人群HPV感染以高危基因型(12种HPV)为主，占27.85%(811/2 912)，平均2.32%；HPV低危基因型(5种)占4.19%(122/2 912) 平均0.84%；HPV中国常见基因型(2种)占4.22%(123/2 912)，平均2.11%。

2.3HPV重感染率及其年龄分布 1重感染检出率20.67%，2重感染5.73%，3重感染1.48%，4重感染比0.45%，5重感染0.07%，6重感染0.03%，多重感染总构成比约占30.00%。1重感染的易感年龄为35～45岁，2重感染为25～34岁，3重感染为20～24岁，4重感染20～29岁，5重感染2例分别为34岁和59岁，6重感染1例为65岁，见表3，表4。

表3 HPV重感染率例数、阳性率和构成比(%)

与5重感染和6重感染比较：1)P<0.01；与4重感染比较：2)P<0.01；与3重感染比较：3)P<0.01；与2重感染比较：4)P<0.01

表4 HPV多重感染的年龄频数分布(n)

3 讨 论

HPV直径大小为50～55 nm，无包膜、双链DNA、依靠宿主细胞来进行复制、转录和翻译等过程；HPV侵入人体，其潜伏于易感的基底层细胞内，进一步拷贝、繁殖于子宫颈鳞状上皮细胞包体内。根据HPV核酸的同源性差异对其进行基因分型，认为其相关序列的同源性在90%～98%内是同一个亚型，距今陆续发现HPV已有多达120个亚型〔1～3〕。

全世界范围内每年新增约40万宫颈癌病例，致使每年有大约20万妇女死于该疾病；发病与HPV的感染密切相关，是造成浸润性宫颈癌与宫颈上皮内瘤变必要的基础条件〔2〕。低危型引起恶变性较少，跟一些性病湿疣感染有关；高危型是跟宫颈上皮内瘤变有密切关系，也可因为不同的地理位置及宫颈癌的病理类型导致不同HPV亚型感染率差异不同。检测HPV的不同亚型对宫颈上皮内瘤变筛查、评估宫颈细胞学改变与进展、治疗后的监测及流行病学调查和病毒疫苗的研制有重要意义〔5～7〕。

本文结果与江雪芳等〔8〕报道HPV感染率为26.12%相一致，不同年龄组之间HPV感染率无显著性差异。本文显示HPV感染以年轻人为主，与法国报道年轻性活跃妇女HPV感染率最高在17～25岁年龄组相近〔9〕。

本文结果提示广州地区HPV类型是HPV16、52、58和CP8304型。另外，HPV亚型的感染有1重到6重感染类型，与国内文献报道相符〔10〕，而且HPV感染的亚型分布具有种群或地域的特点。