应用iTRAQ技术筛选卵巢过度刺激综合征差异表达蛋白

袁 红 王 凯 朱 鹏 戴 勇 袁小红∗

1.深圳市人民医院(518020);2.河南大学护理学院;3.深圳市坪山新区人民医院

卵巢过度刺激综合征(OHSS)是发生于促性腺激素促排卵的一种严重的、可能危及生命的疾病,多见于辅助生殖的超促排卵中[1-2]。其发病率与体外受精(IVF)促排卵方案、诱导排卵习惯以及IVF取消周期标准相关[3]。本研究利用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合液相串联质谱(LCMS/MS)对OHSS患者血液标本进行蛋白质组学分析,通过筛选OHSS差异表达蛋白,寻找可能的生物标记物,以利于对该病早期筛查诊断、干预,从而减少严重并发症的发生。

1 对象与方法

1.1 对象选择

经本院诊断为OHSS的患者及健康体检者,排除糖尿病、严重的心血管疾病、肝肾系统原发性疾病、其他妇科疾病及精神神经系统疾病,各随机抽取20例用于iTRAQ实验检测。于清晨空腹抽取对象静脉血10 ml,4℃静置1h,3000 r/min离心10 min后取上清液,每个样品不少于100 mg,液氮速冻后于-80℃保存,干冰运输。本研究通过医院伦理委员会审批,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

涡旋振荡器、离心机、恒温孵育器、iTRAQ试剂盒(iTRAQ Reagent 8 plex Buffer Kit,iTRAQ Reagent Multi-plex Kit,AB SCIEX公司生产)、8M尿素、胰蛋白酶、10K超滤管(Sartorius Vivacon 500离心浓缩管,商品编号：VN01 H02,Sartorius Stedim)、DTT(商品编号：43815-5G,SIGMA)、IAA(商品编号：1632109,BIO-RAD)、8标iTRAQ 试剂盒、真空冷冻干燥机、ekspert TMultra LC 100-XL、AB SCIEX TripleTOF 5600 plus质谱仪(美国AB SCIEX公司生产)。

1.3 方 法

1.3.1 蛋白酶解 蛋白质定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中,用8M尿素将体系定至125μl;加入现配的5μl 1 M DTT溶液至体系中,混匀后,37℃放置1h;加入现配的20μl 1 MIAA溶液至体系中,混匀后,避光,室温反应1h;吸取所有样品加入到10 k D超滤管中,12 000 rpm(≤14 000×g)离心20 min,弃掉收集管底部溶液;加入100μl尿素至超滤管中,12 000 rpm 离心10 min,重复2次。加入iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer 100μl,12 000 rpm离心20min,弃掉收集管底部溶液,重复3次,更换新的收集管,在超滤管中加入胰蛋白酶,总量2～4μg(与蛋白质量比1：50～100),体积50 μl,37℃反应过夜,次日12 000 rpm离心20min,酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部,再向超滤管中加入50μl Dissolution Buffer,离心并且和上一步的滤液合并。

1.3.2 标记 从冰箱中取出iTRAQ试剂,平衡到室温,将iTRAQ试剂离心至管底。向每管iTRAQ试剂中加入150μl有机溶剂(异丙醇,保证和样品混合后有机相的比例＞70%),涡旋振荡,离心至管底。取酶解样品的一半蛋白溶液(即100μg)转移到新的离心管中,余下的蛋白冷冻保存备用。将iTRAQ试剂添加到样品中,涡旋振荡,离心至管底,室温反应1h,加入100μl水终止反应,用Ziptip脱盐后进行MALDI抽样鉴定,确认标记反应良好,混合标记后的样品,真空冷冻离心干燥,抽干后冷冻保存待用。

1.3.3 高p H反相分级 储液：200 m M甲酸铵(p H 10);流动相A：20m M甲钴胺(p H 10);流动相B：20m M甲钴胺(p H 10),80%ACN;流速0.8ml/min,自动进样。梯度洗脱条件：0～5min,5%B;5～30min,5%～15%B;30～45min,15%～38%B;45～46min,38%～90%B;46～54.5min,90%B;55min 5%B;65min,5%B分析时间65min。真空冷冻离心干燥,抽干后的样品冷冻保存待用。

1.3.4 纳升级反相色谱-质谱进行蛋白质分析（nano RPLC） 根据紫外监测情况,将高p H反相分离得到的组,涡旋振荡并离心后,每组样品复溶,吸取上清上样,采取夹心法上样,Loading Pump流速2μl/min,15 min,分离流速0.3μl/min,分离梯度根据组分1～4和5～10稍作调整。分级后样品抽干,用1/1000甲酸复溶后,经nano高效液相色谱分离后进行质谱分析,正离子扫描方式。一级质谱扫描范围TOF MS：m/z 350～1250;accumulation time：0.25s;二级质谱扫描范围Product ion scan：IDA mumber 30;m/z：100～1500;accumulation time：0.1s;质谱分析原始数据,用软件ProteinPilot5.0(AB SCIEX)进行查库鉴定及定量分析。HPLC分级后得到15个组分(fraction)经质谱分析及ProteinPilot 5.0查库。结果合并后以Peptide P≤0.05筛选过滤。

1.4 生物信息学分析

将用i TRAQ方法筛选出的差异蛋白汇总后,采用Proteinpilot 4.0软件对质谱的结果数据进行分析,鉴别差异表达基因中显著富集的代谢通路或者信号转导途径,并且使用超几何检验的方法,从输入的差异表达基因列表中找出显著富集的代谢通路。对所有差异蛋白进行基因本体(GO)分类注释[4-5],包括表述基因的分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过程。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定得到差异蛋白

采用的i TRAQ技术,筛选出了大批量的肽段和蛋白质。利用Mascot软件中的Scaffold算法对同位素峰面积计算,搜索数据库后完成对蛋白质的相对定量和鉴定。最终在血清中鉴定到二级谱图采集到的MS/MS图谱,经数据库比对命中了22 685个不同的肽段,其代表了3198个蛋白质组(P＜0.01)及其定量信息。与对照组相比,获得64种血清差异蛋白。其中,蛋白质中差异倍数达到1.5倍以上的蛋白17种,上调蛋白为15种,下调蛋白为2种。差异蛋白信息见表1。经筛选差异较为显著的蛋白为血清淀粉样蛋白A-1、炎性介质C反应蛋白、脂多糖结合蛋白。

2.2 GO 注 释

通过GO富集筛选出的上调蛋白的功能涉及10种生物学过程,包括蛋白激活级联、急性时相反应、补体激活,以及凝集素途径、急性炎性反应、补体激活、血凝、凝结、止血、补体的经典激活途径、循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答等过程(表1),分别存在于细胞外间隙、高密度脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白微粒、脂蛋白微粒、胶原三聚体、胞囊体、囊腔、血液微粒、细胞外基质,经过GO富集分析,发现细胞外间隙分布的差异蛋白最多,占比达到57%(图1)。其中,落在细胞外间隙的基因数目为1385种,候选基因数为13种。通过KEGG富集,筛选出的蛋白为丝氨酸蛋白酶2、补体C1Q子亚基、补充C1S因子、血管假性血友病因子,其中落在该KEGG的基因数目为79种,落在该KEGG子类的候选基因数目为4种,富集比率为25.9。

表1 卵巢过度刺激综合征差异蛋白表达列表

图1 GO富集卵巢刺激综合征差异表达蛋白结构类型

3 讨论

OHSS是体外辅助受孕常见的并发症之一,是一种人体对促排卵药物产生的过度反应,会增加多胎妊娠、流产、妊娠期高血压等疾病的发病率。目前,超声监测卵泡大小、形态以及生长速度,监测血流信号,子宫大小及内膜变化具有一定的诊断价值,但对该病早期筛查诊断具有局限性。靶向预测指标以血清抗苗管激素、窦卵泡计数、抑制激素、雌二醇为主。目前控制性促排卵、应用阿司匹林、促性腺激素拮抗剂、卵母细胞体外成熟、滑行疗法和胚胎冷冻在预防卵巢过度刺激中起比较大的作用[6]。所以对IVF-ET患者进行早期筛查诊断、干预治疗,减少严重并发症的发生非常重要。近年来,蛋白质组学技术的不断进步使产前无创诊断逐渐成为可能。蛋白质组学通过对疾病状态下全蛋白表达水平变化的定性定量分析,鉴定与疾病特征及病理过程相关的蛋白质、进而发现新的可用于诊断、预后、治疗反应监测和靶向治疗的生物标志[7]。

本研究通过iTRAQ技术成功筛选出17个表达差异较为明显的蛋白质,通过数据库鉴定出5种有意义的蛋白质,包括丝氨酸蛋白酶2、炎性介质C反应蛋白、补体C1Q子亚基、补充C1S因子、血管假性血友病因子。有研究表明,丝氨酸蛋白酶2的含量高低与感染、免疫性及风湿等疾病存在密切联系[8-10]。丝氨酸蛋白酶2含量升高,可能与OHSS的卵巢肾素-血管紧张素-醛固酮系统被激活产生的免疫应答和反馈调节有关。与Orvieto等[11-14]研究结果相似的是,本研究结果也筛查出炎性介质C反应蛋白,且上调幅度较大。与Grossman等[15]研究相似,本研究提示OHSS的发生可能带来白细胞活动增多、炎症反应、电解质紊乱、凝血功能障碍,甚至血栓形成。补体C1q亚基和补充C1s因子是C1q的重要组成成分,常出现于各种炎性反应疾病,其含量的增高能反映内皮细胞受损的程度[16-19]。因此,血管假性血友病因子上调可能与OHSS带来的机体损伤有关。因OHSS可伴有腔积液、腹水、血液浓缩、卵巢增大等症状,可能与筛查出血管假性血友病因子、丝氨酸蛋白酶2、炎性介质C反应蛋白上调有关。

综上所述,由于OHSS是一个高度复杂、动态发展的过程,由多种因素相互作用的结果。目前尚不清楚免疫蛋白如何上调,其关键信号通路和相关调节机制仍需进一步探寻、研究。