FKBP52、PR、MMP-2和ER在小鼠腺肌症子宫内膜组织中的表达和意义

郭凤羽 王 宁

1.军事医学科学院生物工程研究所(北京,100071);2.国家卫生计生委科学技术研究所

子宫腺肌病(AM)是子宫内膜(包括腺体及间质)直接侵入子宫肌层生长而产生的病变[1]。发病率为25%～40%,近年来有明显上升趋势[2]。临床上约35%的患者无症状,最常见的症状是月经过多(50%)、痛经(30%)和不规则子宫出血(20%),从不同程度上严重影响着育龄妇女的身心健康和生活质量[3]。人群流行病学结果一般认为是由于分娩、宫腔手术等造成子宫内膜或浅肌层损伤,基底层子宫内膜侵入子宫肌层生长而发病。异位的子宫内膜细胞必须具有侵袭、浸润的能力,才能在子宫肌层或其它部位种植和生长[4-5]。Nisolle等[6]将分泌晚期子宫内膜组织移植入裸鼠腹腔,所有移植物都表现增生期组织学特征;腺肌症异位病灶常处于增生期,且对孕激素不敏感[1,7]。说明异位内膜可呈现出异常的生物学行为。但子宫内膜是如何获得侵袭能力,从而侵入子宫肌层导致子宫腺肌症的发生,越来越成为人们研究的重点。目前国内外尚无子宫腺肌病的侵润性与孕酮耐受相关性的研究报道。本实验观察FK506结合蛋白52(FKBP52)、孕激素受体(PR)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和雌激素受体(ER)在子宫内膜腺肌症模型小鼠子宫内膜中的表达,为探讨其在子宫内膜腺肌症中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级CD-1孕1周雌鼠15只,来源于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(实验动物生产许可证号SCXK-2017-004,实验动物使用许可证号：SYXK 2013-0033)。动物购入后在SPF级动物实验室(恒温恒湿、屏障环境)饲养观察1周后进行实验。15只CD-1孕鼠的F1代新生雌鼠45只,分成3组,每组15只。对照组：新生雌鼠于出生第2天每天1次2μl生理盐水灌胃,连续4d。实验组：共2组,新生雌鼠于出生第2天开始分别用0.6,3mg/kg托瑞米芬2μl灌胃,1次/d,连续4d。常规喂养雌鼠5个月。

1.2 实验方法

1.2.1 组织形态学观察 小鼠处死后分离卵巢和子宫,使用4%多聚甲醛固定24h后,制备石蜡包埋切片,用苏木精伊红(HE)染色,观察组织结构。

1.2.2 免疫组织化学观察 子宫内膜组织常规制备成4μm的切片。PR一抗为兔抗小鼠单克隆抗体(滴度为1：200,abcam,USA);FKBP52一抗为兔抗鼠多克隆抗体(滴度为1：400,abcam,USA);ER一抗为兔抗鼠多克隆抗体(滴度为1：200,abcam,USA);MMP-2一抗为兔抗鼠多克隆抗体(滴度为1：200,abcam,USA)。切片经过脱蜡、复水后,用0.1mol/L p H 7.4的PBS冲洗,3%的过氧化氢封闭5～10min。加一抗后于4℃孵育过夜,用生物素标记的二抗。链霉素过氧化物酶和DAB检测阳性信号。

1.2.3 免疫组织化学分析 免疫组织化学染色结果采用半定量H-Score方法评分[8]：随机选择10个视野,阳性染色强度以0～3表示,0分为不着色;1分为浅着色;2分为中度着色、深黄色;3分为深着色、棕黄色或咖啡色。着色细胞所占比例0～25%为1分;＞25%～50%为2分;＞50%～75%为3分;＞75%～100%为4分。10个视野染色强度和着色细胞占比例乘积的平均值做为该组织的组织化学评分。

1.2.4 RNA 提取和 Realtime RT-PCR 按照 TRIZOL试剂(invitrogen,USA)使用说明书提取小鼠子宫组织总RNA。变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性,cDNA合成反应：总体积为20μl的反应体系,含有0.5mg/ml Oligo(d T)18,逆转录反应条件为 65℃5min,37℃ 1min,50℃60min,70℃15min。所用引物：FKBP52：F-5＇CATTGCCATAGCCACCATGAA-3＇,R-5＇TCCAGTGCAA,CCTCCACGATA-3＇;PR：F-5＇GAGCCCACAATACAGCTTCGAG-3＇,R-5＇CGAAAACCTCCAAGGACCATG-3＇;ER：F-5＇TCTGCCAAGGAGACTCGCTACT-3＇,R-5＇CTCCCTCCTCTTCGGTCTTTTC-3＇和 MMP-2：F-5＇CGTGGATCCTATGGGGCCTCTCC3＇,R-5＇GCGGAATTCACTCGCTGGACATCAGGG-3＇;GAPDH：F-5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’,R-5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。实时定量PCR反应条件：95℃孵育3min,94℃变性20s,59℃退火20s,72℃延伸30s。以GAPDH为内参,用Ct值方法表示m RNA表达的丰度,用2-△△Ct法分析数据。

1.3 统计方法

用SPSS22.0软件包进行统计学分析,统计方法采用t检验,P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 腺肌症小鼠模型子宫输卵管形态

药物诱导后5个月时,单侧或双侧腺肌症的发生率为100%。不同浓度托瑞米芬诱导腺肌症小鼠子宫形态比较见图1。

2.2 腺肌症小鼠组织学观察

2.2.1 HE染色 HE染色切片显示,0.6mg/kg托瑞米芬诱导5个月时,小鼠子宫内膜中的腺体向基底层侵入;3mg/kg托瑞米芬诱导的小鼠子宫内膜中,腺体侵入基底膜较深,有的腺体侵润子宫肌层深达外环肌,呈现典型的腺肌症样表现。见图2。

图1 腺肌症模型小鼠子宫输卵管形态

图2 腺肌症模型小鼠子宫内膜组织切片（HE,A×5、B×5、C×5,a×20、b×20、c×20）

2.2.3 免疫组织化学检测 在腺肌症模型小鼠子宫中,PR蛋白主要表达于腺上皮细胞中,间质细胞未见明显表达(图3A);而在对照小鼠中,PR蛋白在腺上皮细胞和基质细胞中均有表达,阳性颗粒染色较深(图3E、F)。FKBP52蛋白主要在模型小鼠的腺上皮细胞中表达,间质细胞中有少量表达(图3B);在对照小鼠子宫内膜中的腺上皮和间质细胞中均有明显表达,且阳性颗粒染色较深(图3F);ER蛋白在模型小鼠子宫的腺上皮和间质细胞的细胞核中均有表达,主要表达于腺上皮细胞中(图3C);而在对照子鼠中表达部位主要在腺上皮细胞的细胞核中,间质细胞的细胞核中表达很少(图3G)。MMP-2阳性主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,在模型小鼠的间质细胞胞浆中有散在的阳性表达颗粒(图3D)。采用H-sSore半定量分析模型小鼠子宫间质和腺体中PR、FKBP52、ER和MMP-2的表达,结果发现：PR蛋白在模型小鼠子宫内膜腺上皮和间质中的表达均低于对照(P＝0.041),尤其是在间质细胞中的表达差异更加明显(P＝0.008)。FKBP52的表达与PR表达结果类似。ER蛋白在模型小鼠子宫内膜腺上皮和间质细胞中的表达均高于对照小鼠(P＝0.032)。MMP-2在模型小鼠腺上皮中的表达明显高于对照小鼠(P＝0.006),在间质细胞中模型小鼠和对照小鼠表达差异不明显。见图4。2.3 Realtime PCR检测小鼠子宫内膜PR、FKBP52、ER和MMP-2的mRNA表达

m RNA表达结果与蛋白表达结果一致,在模型小鼠中,PR表达量略低,ER的表达略高于对照小鼠。FKBP52的表达量低于对照小鼠 (P＝0.005);MMP-2的m RNA表达量高于对照小鼠(P＝0.004),见图5。

图3 小鼠子宫内膜组织中PR、FKBP52、ER和MMP-2的表达

图4 H-Score半定量分析腺肌症模型小鼠子宫内膜组织PR、FKBP52、ER和MMP-2的相对表达强度

图5 腺肌症模型小鼠子宫内膜PR、FKBP52、ER和MMP-2 mRNA丰度的相对表达

3 讨论

目前从分子角度认为子宫肌腺症是一种雌激素依赖性疾病,雌激素持续存在可刺激子宫肌腺症的发生发展。由于AM异位子宫内膜属于基底层内膜,所以对卵巢激素特别是孕激素不敏感[1]。本实验中对PR的检测结果发现：PR主要在腺肌症小鼠子宫的腺上皮细胞的胞浆中表达,阳性染色较浅;而在正常小鼠的子宫中,PR在腺上皮细胞和基质细胞中均有明显的表达,PR在腺肌症小鼠子宫中的明显低于正常对照小鼠,该结果与以往报道结果一致[9]。说明在孕激素不敏感或孕酮耐受在腺肌症形成过程中起重要作用。

当AM进展到一定程度,ER和PR的数量是逐渐减少的。ER由多到少的量变过程,反映了在病变过程中受体含量的减少和对性激素的反应能力的下降,由激素依赖性转化为非依赖性的去分化过程,这种研究结论可以解释AM后期对内分泌治疗效果差的原因[10]。一般文献报道认为腺肌症小鼠模型的构建时间均大于6个月,为了了解腺肌症的发生过程,本实验收集腺肌症小鼠子宫组织是在模型建立的5个月,因此导致模型本实验中检测到ER水平在腺肌症中高于正常对照小鼠,在腺肌症形成的过程中,ER表达的变化趋势是先增加后减少,可能是由于实验中构建的腺肌症小鼠模型建立时间短,模型不能反应腺肌症发病过程的后期或晚期ER的表达情况。

FKBP是近些年发现的介导PR参与反应的分子伴侣,FKBP52是组成P4/PR复合体的重要成分。FKBP52缺陷小鼠实验中,小鼠的表现类似于PRA缺陷小鼠的表型,没有生育力,但是与PRA缺陷小鼠不同的是,孕激素受体A型(PRA)缺陷的小鼠除了受精卵不能着床外,生殖器官的发育也不完善。由此也说明FKBP52在着床过程中的重要性。这种现象与人类子宫内膜异位症中PRA降低,PRB和FKBP52的缺失是一致的。作为PR信号途径中的一个调节子,FKBP缺失使功能性PR受体的水平不足因而导致子宫内膜异位症中P4的耐受。

子宫腺肌病虽属良性疾病,却具有恶性肿瘤的一些特征,最显著的特征是具有细胞侵袭能力,能局部或远程转移,浸润并损伤其他组织[11-14]。近年来研究已证实MMPs在子宫腺肌症中有非常重要的作用[15],MMPs初期向子宫肌层侵润的细胞是子宫内膜间质细胞,继而是内膜腺细胞侵润,子宫内膜癌细胞具有同样的MMPs、MMP-m RNAs发现模式,此模式提示异位内膜细胞的特性已经异位内膜腺体—间质细胞的相互作用可能是MMPs所介导的。基质金属蛋白酶是细胞外基质降解和重建过程中最关键的一组蛋白酶[16-18]。本实验中检测结果发现：不论是m RNA水平还是蛋白水平,在腺肌症模型小鼠的子宫中MMP-2的表达均高于正常对照小鼠,说明子宫内膜细胞的侵袭性是腺肌症形成的直接因素。

综上所述,FKBP52和PR的表达在腺肌症小鼠子宫中低于正常小鼠,ER和MMP-2的表达高于正常小鼠,这些结果与腺肌症形成中对雌激素敏感,对孕激素耐受,侵袭性增加密切相关,可能是腺肌症发病机理的分子基础;FKBP52、PR、ER和MMP-2在此过程中如何发挥调控作用,还有什么因素或调控机制参与其中还需要进一步研究。