2014-2016年我国江苏地区猪流行性腹泻病毒S基因的序列分析

焦 点,孙 杰,茅爱华,俞正玉,郭容利,朱 琳,范宝超,袁万哲,李 郁,何孔旺,李 彬

(1. 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京210014 ; 2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036 ;3.河北农业大学西校区动物医学院，河北保定071000)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED) 是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种肠道传染病，发病猪主要表现为腹泻、呕吐、消瘦和死亡,主要发病于冬春季。各年龄段的猪都会感染，哺乳仔猪尤为严重。该病1978年首次报道于比利时和英国，之后在我国多以散发为主[2]。从2010 年末开始，我国暴发以新生仔猪严重腹泻、高发病率及高死亡率为主要特征的腹泻疫情，给养猪业造成了严重的经济损失。2013 年美国也开始暴发仔猪腹泻疫情，从遗传进化分析来看，美国的流行毒株与我国AH2012亲缘关系接近，并出现了S-Indel型的新型缺失毒株。日本、加拿大、韩国等国也相继暴发此病，尽管一些疫苗的应用对该病的控制发挥了重要作用，但直至目前该疫情在部分地区仍然有不同程度的流行和发生。

PEDV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属I群的成员，基因组为单股正链RNA[8]。根据其他冠状病毒的S蛋白可将其划分为S1(第1～789位氨基酸)和S2(第790～1383位氨基酸)。S蛋白在与受体细胞结合吸附、膜融合和诱导机体产生保护性中和抗体等方面发挥重要的作用[10-11]，因此分析PEDV S蛋白对于当地流行毒株的流行情况和遗传变异有重要意义。目前，在S基因鉴定出4个表位，分别为499 aa～638 aa、748 aa～755 aa、764 aa～771 aa、1 368 aa～1 374 aa[12-13]。本研究对江苏部分猪场20份病料进行PEDV的检测，对S基因测序分析，为该病的防制提供了流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集 共20份组织样品于2014-2016年采集于江苏地区腹泻发病猪场，病料样品为不同日龄发病猪的肠道及粪便，采集后于-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂和仪器 Promega公司Reverse Transcription System反转录试剂盒; Abm公司Safe-Green 2xPCRTaqMaster Mix PCR试剂盒; BIOWEST公司AGAROSE G-10琼脂糖凝胶；TaKaRa公司DS 2 000 DNA Marker；Omega公司Total RNA Kit II试剂盒； TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice PCR仪；北京市六一仪器厂DYY-11型电泳仪；eppendorf (German)离心机；AXYGEN 胶回收试剂盒。

1.3 引物的设计与合成 参照GenBank已发表的PEDV的基因序列，设计如下4对引物，见表1，南京斯普金公司合成。

表1 设计的4对特异性引物

1.4 核酸模板的制备 取粪便或肠液，按1∶5用PBS稀释后研磨，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min取上清，按照OMEGA Total RNA Kit II说明书提取病毒RNA，置于-70 ℃保存备用。利用Reverse Transcription System反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。

1.5 PCR扩增 PCR反应总体积25 μL, 体系为：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,DNA模板 2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。

PCR扩增反应程序： 95 ℃预变性5 min后进入以下循环：95 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃ 1.5 min；共进行30个循环，彻底延伸72 ℃ 10 min。取全部25 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观察扩增情况，并对阳性条带切胶回收，连接pMD19-T克隆载体，转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性菌送至南京思普金公司测序。

1.6 S基因序列分析 选取部分欧美、韩国、中国等地的参考毒株，毒株信息见表2，用DNA Star软件对所获得的20株PEDV S基因序列进行拼接，使用软件MegAlign进行同源性分析，MEGA 5.0作遗传进化分析，绘制其遗传进化关系树；用TMHMM Server,v.2在线软件(http://www.cbs.dtu. dk/ services /THMM/)对PEDV S基因进行跨膜区域预测。

表2 PEDV参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果 分别用4对引物对PEDV 的S基因进行PCR分段扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分析，可见到4条特异性扩增片段，与预期结果相符，图1。

图1 PEDV S基因的4个片段分段扩增

2.2 PEDV S基因同源性及N端氨基酸分析 20株毒株的核苷酸(氨基酸)同源性为95.1%～99.8% (94.6%～99.9%), 与我国流行毒株AH2012、疫苗毒株Attenuated DR13、欧美毒株CV777的同源性为95.5%～99.3%(94.6%～99.0%)、93.5%～96.0%(92.5%～96.3%)、93.6%～95.8%(93.0%～96.5%)。

所测20株毒株的氨基酸差异性主要集中于S1端，毒株JSCZ1601出现了特异性的缺失，与CV777相比，在58～59位缺失了2个氨基酸(SS)，见图2。

图2 毒株JSCZ1601 S基因编码的氨基酸序列特异性变异位点分析

-:与参考毒株CV777氨基酸相同 ; .:缺失

2.3 S基因遗传进化分析 由图3可知，PEDV毒株可分为2个大群(G1、G2)。12株流行野毒株位于G2b分支上，8株属于G1群S-Indel型。G2群的毒株属于流行毒株，和我国原先暴发的毒株(AH2012、AH2012/ 12、BJ-2011-1等)更为接近，其中韩国毒株独自分为一个亚枝；G1毒株属于经典毒株，8株位于G1的毒株全部位于S-Indel基因缺失株亚群，与位于G1b群的疫苗(CV777、Attenuated DR13、JS2008等)毒株群亲缘关系较远，同时我国的S-Indel群毒株与美国S-Indel群毒株不在一个亚枝内，说明我国的S-Indel基因缺失株与美国的S-Indel群毒株关系较远。

图3 基于S基因的遗传进化分析

▲:所测野毒株

2.4 抗原表位分析 对20株PEDV毒株S蛋白表位进行分析，SS2和2C10相对保守，主要的变异位于COE区域和SS6。在COE区域共有21个氨基酸的点突变，包括A522 S、G525 D、S527G、S528G、V532I、F541I、D547N、T554S、F556S、S588G、L596F、G599S、D604N、G614V、L617 F、T618 V、T626 E，其中有3个位点突变成2个不一样的氨基酸，包括K568R或N、A610E或者D、E638Q或者V，还有1个点突变位点变成3个不一样的氨基酸 L526 H或P或R。SS6的点突变包括L764S或者Y、D766 Y、F或者S，见图4。

图4 野生株和参考株的S蛋白抗原表位的比较

-:与参考毒株CV777氨基酸相同

2.5 PEDV S基因跨膜区域变化 G2b流行株大部分在1 328～1 350位，而JSCZ1601在1 326～1 348位形成1个跨膜螺旋；S-Indel型毒株在1 325～1 347 位形成1个跨膜螺旋，主要是由于氨基酸的缺失或是插入使其跨膜螺旋区域发生了偏移，跨膜螺旋的偏移可能会造成病毒毒力的变化，影响机体对抗原位点的识别。

3 讨论

PEDV是危害养猪业的重要病原之一，其传染性强、危害大，哺乳仔猪和育肥猪均能感染。2010年10月，中国南方暴发PED，给养猪业造成巨大损失[14]。对S蛋白进行基因变异分析，可在一定程度上反映PEDV的变异情况，本试验对PEDV阳性样品S基因进行克隆测序，分析近年来PEDV的变异情况，为PED的防控提供一定的科学依据。

对S基因序列分析结果可知，毒株JSCZ1601存在特异性的缺失，与CV777相比，在58～59位缺失了2个氨基酸(SS)，说明在PEDV的进化演变过程中，突变是一种手段；此外，美国在2014年报道了S-Indel 毒株的存在，研究发现美国的S-Indel毒株USA/Iowa107/ 2013的S1段与CH/S最为接近，而S2段与CH/ZMZDY/11最为接近，说明存在一定的重组现象并出现了新型毒株。这次研究中发现，我国S-Indel毒株与美国S-Indel毒株处在一个亚群，但是不在一个小的分支里，说明我国的毒株同样存在重组演变的过程，与美国的S-Indel型毒株亲缘关系较远。我国毒株多属于流行毒株G2群，美国的流行毒株单独处于一个大的亚群，中国流行毒株同样独自形成一个亚群，说明同属于G2群，但是亲缘关系并不是很近；位于G1群的毒株都属于S-Indel型，与疫苗毒株不在同一个分支，亲缘关系较远。

从抗原表位分析来看，突变位点主要集中于COE区域和SS6区域，同时跨膜螺旋区域的偏移，这些变异可能是导致病毒毒力增强的原因，而变异导致病毒的致病机理变化还有待研究。抗原表位的变化以及跨膜螺旋区域的偏移，可能引起PEDV的免疫逃避机制，影响机体对抗原位点的识别，推测这可能是近些年来商品化疫苗保护效力降低的原因，开发新型疫苗具有重要意义。

本研究通过对PEDV S 基因测序分析，了解了当前PEDV 变异毒株的流行情况，以及S基因的变异情况、突变位点、表位和膜螺旋区域的变化，为我国PEDV的防控提供基础。