枯草芽孢杆菌对铅暴露鲫鱼的代谢及保护作用

张 蕾，郭曦尧，尹玉伟，茆安婷，代 静，程 义，秦 悦，王云翔，李月红

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

工业“三废”、农业生产以及生活污水的大量排放，使得水体重金属含量居高不下。目前，水体污染的重金属主要包括铅、汞、镉、锌、铜等。铅作为一种在自然界中普遍存在的重金属，具有不易降解、强神经毒性等特点，在微量条件接触下便可对水生动物造成明显的毒害作用[1]。在淡水系统中，鱼样品被认为是评估衡量重金属污染潜力的最具指示性的因素之一，而重金属在鱼类组织中的生物积累最终会对人类健康造成威胁[2]。因此，在环境污染的背景下，研究重金属在鱼类机体中的生物蓄积及代谢不容置疑。

如今，利用微生物吸附法净化养殖水质，从而达到改善和恢复养殖水体的生态环境，被越来越多地应用于生产[3]。研究显示[4]，不少微生物材料在将重金属浓度1 μg/mL降低到μg/mL的千分之一水平时具有很高的根除率。但是，对于微生物是否可以有效清除动物机体内重金属含量的报道还较少。不少报道还指出[5]，益生菌不仅可以有效吸附重金属离子，而且在缓解氧化应激与氧化损伤等方面有着显著的表现。因此，本试验尝试将一株鱼源性枯草芽孢杆菌添加至饲料中，通过检测不同浓度铅暴露鲫鱼组织内含铅量及躯干肾抗氧化酶活力变化，评价该菌种对其各组织中铅代谢的促进及氧化损伤的缓解作用。从而为微生物饲料添加剂在重金属中毒方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康鲫鱼360尾，均质量60±1.65 g，由长春市新立城水库提供。

1.2 主要试剂及仪器 试剂：三水合醋酸铅[(CH3COO)2Pb·3H2O]，购自天津永晟精细化工有限公司。配置铅溶液母液：10 mg/L Pb2+、称取18.3 g三水合醋酸铅，充分溶解于1 000 mL双蒸水，配置好后置于密封瓶中保存备用；浓硝酸(HNO3)；浓高氯酸(HClO4)；铅标准溶液；SOD、CAT、GSH及T-AOC试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司。仪器：日本岛津AA-6880F/AAC型原子吸收分光光度计；Epoch2型微孔板分光光度计。

1.3 试验设计 实验鲫鱼经两周驯化饲养后，选取健康、质量相近的鲫鱼随机分为8个处理组，每个处理组3个重复，每个重复15尾鱼。实验Ⅰ组为对照组；实验Ⅱ组为益生菌对照组；Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ组分别控制水体铅浓度为0.05 mg/L Pb、0.5 mg/L Pb、1 mg/L Pb；益生菌治疗组(Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ组)分别为0.05 mg/L Pb+WB600、0.5 mg/L Pb+WB600、1 mg/L Pb+WB600，实验为期60 d。

1.4 饲养管理 试验开始后每天8点和18点两次投喂，按鱼体重3%日投喂量饲喂。饲养水为充分曝气的自来水，每缸水为80 L，每2天换一次，换水量为总量的1/3，水温维持在24 ℃±2 ℃，水的pH值为7.2～7.4，水中溶解氧为7.2～7.6 mg/L，保持供养泵24 h开启，实验周期为60 d。

1.5 菌株活化及饲料制作 WB600为一株鱼源性枯草芽孢杆菌，并保藏于-80 ℃冰箱中。参照《微生物学实验技术》的方法并稍作修改，将该菌种接入LB液体培养基(pH值 7.2～7.4)中进行活化，按照2%接种量进行扩增，37 ℃条件下培养至稳定期，6 000 r/min(4 ℃)离心10 min，弃上清液得到菌泥，使用PBS洗涤，重复3次后重悬于无菌生理盐水中(生理盐水∶原菌液=1∶100)，将浓缩菌液用压力喷嘴均匀喷入颗粒饲料中，现做现用。经过多次试验确定菌液与饲料的添加比例为100 mL∶800 g，使饲料中活菌含量保持为109CFU/g。

1.6 样品处理 组织采集冰盘上剖检，取脑、鳃、肝胰脏、躯干肾、肠及肌肉，用4 ℃预冷的生理盐水洗净并用吸水纸吸干后置于无菌EP管中-80 ℃保存待用。

1.7 脑、鳃、肝胰脏、躯干肾、肠、肌肉中铅浓度的测定 检测前，准确称取样品，将样品置于三角锥瓶中后放入数粒玻璃球，加入10 mL混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1)并加盖浸泡过夜。使用微波消解炉消解后消化液成无色透明或略带黄色，待消化液冷却，将其转入25 mL容量瓶中，用去离子水少量多次洗涤三角锥瓶后洗液合并于容量瓶中定容，使用原子吸收光谱分析仪测定其铅含量。用同一方法做试剂空白试验。

1.8 躯干肾中抗氧化酶活力的测定 准确称取组织重量后按照重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积生理盐水，剪碎组织并在冰水浴条件下制备匀浆，2 500～3 000 r/min离心10 min，取上清待用。CAT、SOD、GSH及T-AOC测试的具体操作按南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行。

1.9 数据处理与分析 试验所得数据均用平均值±标准误(x±SEM )表示，采用IBM SPSS Statistics 20软件Tukey单因素分析法统计分析。试样中铅在鱼体组织的含量按以下公式计算：

注：X：样品铅含量； C1：测定样品铅含量； C0：试剂空白液铅含量； V：样品处理后总体积； m：样品质量

2 结果

2.1 脏器铅浓度变化 如表1所示，与Ⅰ组相比，鲫鱼各组织中铅含量均显著升高(P<0.05)，且与水体铅浓度呈正相关。铅在鲫鱼的富集量取决于组织的不同，各组织铅积蓄量由高到低依次为：鳃>躯干肾>肠>肝胰脏>脑>肌肉。在0.05 mg/L铅暴露下，相比于Ⅳ组，Ⅲ组鲫鱼鳃、肝胰脏、躯干肾、肠及肌肉铅含量均显著降低(P<0.05)，脑中铅含量降低，无显著差异(P>0.05)。在0.5 mg/L铅暴露下，相比于Ⅵ组，Ⅴ组鲫鱼脑、躯干肾、肠及肝胰脏中铅含量显著降低(P<0.05)，肌肉中铅含量略微降低，无显著差异(P>0.05)；Ⅴ组鳃中铅含量低于Ⅵ组，但无显著差异(P>0.05)。在1 mg/L铅暴露下，相比于Ⅷ组，Ⅶ组鲫鱼脑、躯干肾、肠及肝胰脏中铅含量显著降低(P<0.05)，肌肉中铅含量降低，但无显著差异(P>0.05)；Ⅶ组与于Ⅷ组鲫鱼鳃中铅含量，无显著差异(P>0.05)

2.2 躯干肾抗氧化酶活性变化 如图1～4所示，与Ⅰ组相比，Ⅱ组鲫鱼躯干肾CAT、SOD、GSH及T-AOC水平均显著提高(P<0.05)；在0.05 mg/LPb、0.5 mg/LPb及1 mg/L Pb浓度下，益生菌治疗组鲫鱼躯干肾CAT、SOD及GSH水平均显著高于铅暴露组(P<0.05)；相比于铅暴露组，在0.05 mg/L Pb及1 mg/L Pb浓度下益生菌治疗组鲫鱼躯干肾T-AOC水平显著提高(P<0.05)，在0.5 mg/L Pb浓度下无显著差异(P>0.05)。

表1 鲫鱼各组织铅浓度 (ng/g)

注：标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)，标有相同字母者表示差异不显著(P>0.05)

图1 躯干肾CAT活性变化

图2 躯干肾SOD活性化

图3 躯干肾GSH含量变化

图4 躯干肾T-AOC活性变化

注：标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)，标有相同字母者表示差异不显著(P>0.05)

3 讨论

3.1 不同浓度铅暴露下鲫鱼各组织铅含量变化 铅可通过表皮、腮溶解或经过消化道进入鱼体。这种重金属容易蓄积在鱼体各组织，如腮、肝胰脏、肾脏等部位，并通过血脑屏障，从而对鱼类的健康造成各种不利影响[6]。Meyer等[7]将小龙虾暴露于20 mL/L铅溶液和2 mL/L镉溶液中处理10周后发现，铅、镉离子在消化腺及腮中累积量很高，而后肠和肌肉组织表现出很低的水平。Wu等[8]研究了白虾在不同浓度铅暴露下各器官铅积累效应，结果显示，所有研究的组织中，最低的铅积累在肌肉组织中。其他相关报道也显示[9-10]，鳃、躯干肾、肠道及肝胰脏等器官是鱼类机体重金属蓄积的主要器官，肌肉并不是主要的重金属堆积组织。本试验中，我们可以观察到鲫鱼各组织铅含量与水体铅浓度呈正相关关系。其中，鲫鱼腮、躯干肾、肠及肝胰脏的铅含量显著高于脑和肌肉，这与以往的研究结论相似。腮丝含有极高浓度的铅，可能是由于长期直接接触含有铅离子的水体所导致；而脑中所含铅量较低表明，血脑屏障虽有一定的保护作用，但随着时间及铅浓度的提高，大量铅离子依旧能进入脑组织中。Ewa等[11]通过饲喂普鲁士鲤鱼含铅饲料后发现，铅在不同组织中的生物蓄积浓度由高到低为：肾>肝>鳞>鳃>肠>肌肉>皮肤。这也表明，铅通过不同途径进入动物机体，其各组织铅蓄积量也会不同。

3.2 枯草芽孢杆菌对鲫鱼各组织的铅代谢作用 相关研究显示[12-13]，一些益生菌在体外对重金属离子有很好的结合能力。Zhai[14]等的试验已证明乳酸杆菌菌株对小鼠中的镉和铅毒性具有保护作用，通过口服乳酸菌有效的减少了小鼠肠道镉及铅的吸收，并减少了其他组织中镉和铅的积累。在本试验中我们也可以看到，0.05 mg/L的铅暴露下，益生菌治疗组鲫鱼脑、鳃、肝胰脏、躯干肾、肠及肌肉内铅蓄积量均低于铅暴露组。而0.5 mg/L及1 mg/L的铅暴露下，益生菌治疗组鲫鱼脑、肝胰脏、躯干肾及肠铅蓄积量均显著低于铅暴露组(P<0.05)，但鳃及肌肉中铅蓄积量无显著差异(P>0.05)；这是由于WB600仅通过口服方式进入鲫鱼机体，水体中WB600的菌落数较少不足作为有效的重金属吸附剂来清除水体中的铅离子，因而导致在稍高浓度的铅暴露下，益生菌治疗组鲫鱼鳃中铅含量与铅暴露组无显著差异(P>0.05)。WB600可能通过静电力或络合反应吸附了肠道中大量的铅离子，并加速肠道代谢，从而减少了鲫鱼肠道中的铅蓄积量。而WB600在鲫鱼机体内或产生大量的次生代谢物，并随血液流经鲫鱼各部位，该产物可能是导致脑、肝胰脏及肾脏铅含量降低的主要原因。

3.3 枯草芽孢杆菌对鲫鱼躯干肾抗氧化酶活力的影响 大量铅离子的进入导致了机体氧化应激反应的发生，而益生菌可促进或降低酶类抗氧化物的活性从而尽可能保证动物机体抗氧化系统的平衡[15]。Bhakta等[16]通过体外研究发现，益生菌具有降低由重金属毒性引起的氧化应激；Balakrishnan等[17]以大鼠为试验对象，对其皮下注射重铬酸钾后给予口服干酪乳杆菌，结果显示，该菌株可保护肾脏等代谢器官免受来自重铬酸钾诱导的氧化应激。本试验中，在3种不同浓度铅溶液暴露下，鲫鱼在口服WB600后其肾脏抗氧化酶活性均得到提高。这表明，该菌株对于铅毒性起到了一定缓解作用。

如此看来，饲喂枯草芽孢杆菌能有效降低鲫鱼机体各组织中的铅积蓄量，提高机体抗氧化能力，减少铅暴露造成的氧化损伤。该试验结果可为枯草芽孢杆菌的应用提供理论依据，而其具有的易获得、可大规模生产、安全性高、益生强等特点更值得推广使用。