致仔猪腹泻沙门菌分离鉴定与耐药性分析

刘 燕

(河南农业职业学院牧业工程学院，河南中牟451450)

近几年，随着我国畜牧业经济的发展，猪的养殖数量逐渐增多，已经形成了规模化养殖模式，在猪的养殖过程中，仔猪的腹泻成为临床中常见的疾病，其感染率和死亡率均较高，给养殖户造成严重的经济损失[1]。仔猪腹泻主要由传染性病原感染以及非传染性因素等引起，传染性因素包括细菌、病毒以及其他病原的感染，其中以细菌引起的仔猪腹泻在仔猪感染性腹泻中占有较大比重，尤其致病性大肠杆菌和沙门菌引起的仔猪腹泻临床中为最常见[2]。沙门菌肠杆菌科一种革兰阴性短杆菌，可以起动物及人发病，也是引起人们食物中毒的主要病原菌[3]。仔猪沙门菌病又称仔猪副伤寒，是由沙门菌属中的猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等不同血清型沙门菌引起的一种仔猪的传染病，主要表现为败血症和坏死性肠炎，其中败血型沙门菌可以引起仔猪黄色水样腹泻，结肠炎型沙门菌病可以引起弥散性坏死性结肠炎和盲肠炎[4-5]。沙门菌引起仔猪腹泻问题日益严重，当发生该病时，应进行药敏试验分析耐药性，合理用药，提高治疗效果。 本试验从中牟地区规模化的养殖场采集患腹泻仔猪粪便、肠内容物等样品120份中。对分离得到57株沙门菌进行致病性和耐药性分析，为该地区沙门菌引起仔猪腹泻的防治提供参考依据。

1 材料

1.1 病料来源 2017年4月份～2018年3月份，从中牟地区规模化的养殖场采集患腹泻仔猪粪便、肠内容物等样品120份，进行病原菌的检测。

1.2 主要试剂及仪器 普通琼脂培养基、BS培养基、营养肉汤，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；肠杆菌科生化鉴定条、药敏纸片，均购自北京天坛药物生物技术开发公司；DL-2000 Marker、2×TaqMarker Mix，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；细菌 DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；7%绵羊脱纤血液琼脂培养由本实验室自制，多功能梯度 PCR仪(VeritiTm 96-Well Thermal型)由美国 ABI 公司生产；恒温培养箱由上海经济开发区沈荡中新电器有限公司生产；常规的试剂及仪器由本实验室提供。

1.3 实验动物 体重25±2 g左右昆明系小鼠290只，购自郑州市实验动物有限公司。

2 方法

2.1 细菌分离培养 将采集的患腹泻仔猪粪便、肠内容物等样品，加入无菌的PBS中，离心，取上清接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃恒温培养12 h～16 h，选取优势生长菌分别接种于BS琼脂培养基上，37 ℃恒温培养12 h～16 h后，挑取单个菌落接种普通培养基纯化培养后，革兰染色观察细菌形态，另外挑取纯化培养的细菌接种营养肉汤中37 ℃恒温震荡培养12 h后，进行生化鉴定与药敏试验。

2.2 细菌的生化试验鉴定 取纯化的分离菌株接种于肠杆菌科生化鉴定条中，在37 ℃恒温培养18 h～24 h后，用ATB自动生化鉴定系统鉴定细菌的生化特性。

2.3 细菌的PCR鉴定 取纯化的培养的分离菌株用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，参考文献[6]设计沙门菌的特异性引物(表1)，对分离菌株进行PCR鉴定。PCR反应体系与条件，2×TaqMix 12.5 μL，Primer Mix(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板各2 μL，ddH2O 补25 μL；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 35 次；72 ℃ 10 min。将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录参考基因序列进行同源性比较。

表1 引物序列

2.4 致病性试验 调整分离菌株的菌液浓度为(108CFU/mL)，每株分离菌株通过灌胃的方式接种5只小鼠，接种剂量为0.25 mL，对照组给予等量的无菌的生理盐水。攻毒12 h后，观察7 d记录每组的发病及死亡情况，对于死亡的小鼠剖检进行细菌分离与鉴定。

2.5 药敏试验 分离菌株药敏试验按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断。

3 结果

3.1 细菌分离培养与形态学观察结果 采集的患腹泻仔猪粪便、肠内容物等样品，在血液琼脂培养基上长出了白色、光滑湿润、边缘整齐的菌落；在 BS 琼脂培养基上长出了黑色、光滑、有光泽的菌落；普通培养基上能长出光滑、圆形、灰白色、湿润的小菌落。革兰染色镜检可见无荚膜和芽孢、散在的革兰阴性短杆菌。与报道沙门菌培养特性和形态特征一致，据统计120份样品中分离到了57株沙门菌。

3.2 细菌生化特性鉴定结果 57株分离菌株能发酵麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、枸橼酸盐，产酸不产气；不发酵尿素、酵乳糖、蔗糖；吲哚试验呈阴性，产生H2S；经ATB自动生化仪鉴定为沙门菌，评定结果合格率在98.9%～99.9%之间，与报道沙门菌生化特性一致，3.3 细菌PCR鉴定结果 用沙门菌的特异性引物对分离菌株进行了PCR 鉴定，结果显示，5株分离菌株均扩增出大约为184 bp左右的的目的条带(见图1)。分离菌株PCR产物测序结果与GenBank数据库中登录的沙门菌株参考的序列同源性在98.9%～99.8%之间。证实57株分离菌株为沙门菌。

图1 部分菌株PCR扩增与监测结果

M:DL-2 000 Marker; 1-6:分离菌株； 7:空白对照

3.4 致病性试验结果 在攻毒后的36 h～48 h，试验小鼠出现精神沉郁，严重腹泻，严重的出现死亡，对死亡的小鼠剖检，无菌采集肝脏、脾脏等分离到了沙门菌，直到7 d试验结束，对照组小鼠健康存活，据统计32株分离菌株对小鼠具有致病性。因而证实32株沙门菌为致病性菌株。

3.5 药敏试验结果 由表2可知，药敏试验结果显示，32株致病性沙门菌对头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星、恩诺沙星4种药物耐药性在25.0%～37.5之间；对氟苯尼考、阿米卡星、强力霉素、林可霉素、庆大霉素、多黏菌素、磺胺间甲氧嘧啶7种药物耐药性在40.6%～78.1%；对大观霉素、新霉素、阿莫西林、青霉素、氨苄西林5种药物耐药性在87.5%～100%之间，且存在多重耐药性。

表2 分离菌株的药敏试验结果 (n=32)

4 讨论

沙门菌在自然界分布广泛，是一种人兽共患的条件性病原菌，可以引起多种家畜家禽及人发病，通过污染食品引起人们的食物中毒，也是引起腹泻的重要病原菌之一[7]，沙门菌具有严格的宿主特异性，当仔猪感染沙门菌后，主要在仔猪的肠道内进行生长繁殖，通过肠道上皮细胞进入仔猪的体内，再通过血液循环进入全身的组织器官，进而导致全身感染，严重着出现菌血症，并引起仔猪的腹泻、发热和肠道炎症等症状。沙门菌主要传染源为带菌猪和病猪，并且带菌猪和病猪可以长期带毒和排毒，该菌可以通过接触传播和水平传播两种方式进行传播，导致沙门病广泛流行[8]。本试验从中牟地区规模化的养殖场采集患腹泻仔猪粪便、肠内容物等样品120份中分离鉴定了57株沙门菌，其中32株为致病性沙门菌，因而证实了该地区仔猪沙门菌感染严重，在该地区流行，应引起重视。沙门菌为人兽共患的条件性病原菌，当饲养管理不善、环境条件变化等应激因素，可以致使动物机体防卫机能下降，引发该病的发生与流行，预防本病的同时应该加强平时的饲养管理，提高机体的免疫力。

沙门菌肠杆科菌，具有血清型众多易产生耐药性特点，由于沙门菌耐药机制发生改变，耐药谱不断扩大，耐药性通过多种途径在不同菌株之间传播造成在不同菌株对抗生素产生严重的耐药性，同时沙门菌可以传播给人类，直接危害着人类的健康[9]。本试验结果显示，32株致病性沙门菌对头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星等4种药物耐药性在25.0%～37.5%之间；对氟苯尼考、阿米卡星、强力霉素等7种药物耐药性在40.6%～78.1%之间；对大观霉素、新霉素、阿莫西林等5种药物耐药性在87.5%～100%之间，且存在严重多重耐药性。与陈如[2]、王伟[6]和姚明等[10]报道的仔猪沙门菌耐药性存在一定的差异性。可能与沙门菌流行的地区和血清型有关，也与抗生素药物的使用有关。当仔猪发生沙门菌病时，应该进行了药敏试验分析，选择敏感的药物，交叉合理用药，提高治疗效果。同时注意环境的消毒。