两种鸡传染性法氏囊病疫苗免疫1日龄商品肉鸡的效果比较

赵起超，薛 佳，张国中

(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.诗华诺康科技发展(北京)有限公司，北京朝阳100016)

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种主要危害雏鸡和青年鸡的烈性、高度接触性传染病[1]。感染鸡的典型剖检变化是法氏囊出现水肿、胶胨样渗出、出血、坏死和萎缩等病变，早期感染通常会引起严重的免疫抑制[2]。IBDV分为经典株、超强毒株(vvIBDV)和变异株[3]。vvIBDV能够造成比经典株更严重的病变和更高的死亡率[4]。IBDV变异株引起的临床症状和死亡率则相对较低[5]。在我国vvIBDV和IBDV变异株普遍存在[6]。

利用IBD灭活苗免疫种鸡可以为雏鸡提供更高、更均匀的母源抗体，从而保护雏鸡免受IBDV早期感染[7]。但高滴度的母源抗体会影响IBD常规活疫苗的免疫效果，因此商品肉鸡免疫IBD常规活疫苗的时间通常在12日龄以后。IBD抗原抗体复合物疫苗可以免受雏鸡母源抗体的影响，用于有母源抗体的1日龄雏鸡或18胚龄鸡胚免疫[8]。目前这种疫苗已经在世界范围内得到了广泛的应用。含大肠杆菌表达的IBDV VP2的灭活疫苗[9-10]，例如新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗，其产品标签和说明书上并未标注可用于1日龄免疫。但在田间，由于孵化厅免疫的普及和人工成本的压力，很多鸡场正在尝试采用1日龄免疫1次IBDV VP2蛋白灭活疫苗的方式预防IBD，其效果未知。

本试验将IBD抗原抗体复合物疫苗(囊胚宝)和含IBDV VP2蛋白的亚单位灭活疫苗-新城疫(ND)、禽流感(AI-H9)、IBD三联灭活疫苗(新流法)免疫1日龄商品肉鸡，通过抗体检测和对IBDV超强毒株(vvIBDV)的攻毒试验比较了两种疫苗的免疫保护效果，为肉鸡养殖场选择法氏囊疫苗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 受试疫苗 鸡传染性法氏囊病复合冻干活疫苗(W2512 G-61株)：简称“囊胚宝”，由某国外公司生产；ND+AI(H9)+IBD-VP2三联灭活疫苗：简称“新流法”，市场购买；ND+AI(H9)二联灭活疫苗：简称“新流”，由国内某公司生产。

1.2 攻毒毒株 IBDV超强毒株(vvIBDV)，由中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心提供。

1.3 试验动物 1日龄白羽商品肉鸡70只，购自江苏八达畜禽有限公司。

1.4 试剂盒 IBDV抗体ELISA检测试剂盒：简称“经典型试剂盒”，为IDEXX产品，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；IBDV-VP2抗体ELISA检测试剂盒：简称“VP2专用试剂盒”，为Symbiotic产品，由中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心提供。

1.5 隔离器 由浙江诗华诺倍威生物技术有限公司提供。

1.6 PCR/RFLP/测序 由中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心完成。

1.7 攻毒用毒株的繁殖复壮和BID50测定 将IBDV超强毒以点眼的方式感染4周龄SPF鸡，72 h后剖鸡观察法氏囊病变，检测其BID50。

1.8 攻毒保护试验

1.8.1 试验分组 将10只1日龄商品肉鸡采血后淘汰。剩余60只鸡随机分为6组，每组10只。A1、A2组每只鸡1日龄颈部皮下注射免疫“新流法”灭活疫苗0.15 mL；B1、B2组每只鸡1日龄颈部皮下注射免疫“囊胚宝”1羽份、新流灭活疫苗0.15 mL；C1、C2组为空白对照组不免疫。A1+A2、B1+B2、C1+C2三个组合的鸡分别饲养于3个不同的隔离器中。于28日龄时将A1、B1、C1三组鸡分别移至单独的隔离器中进行攻毒。剩余的A2、B2、C2组继续饲养至42日龄。

1.8.2 IBD抗体检测 分别利用经典型和VP2专用试剂盒检测。检测1日龄、22日龄、28日龄、35日龄和42日龄鸡IBDV-ELISA抗体。在统计抗体结果时，22、28日龄A1和A2组免疫背景相同，合并计为A组；B1和B2组免疫背景相同，合并计为B组；C1和C2组免疫背景相同，合并计为C组。同时为方便表达，在35、42日龄时A2、B2、C2组也分别简化表示为A、B、C组。

1.8.3 攻毒保护试验 于28日龄时利用vvIBDV以点眼的方式对A1、B1、C1组鸡进行攻毒，攻毒剂量为103BID50/只。攻毒后第4天对攻毒鸡只进行剖检，记录剖检变化；利用RT-PCR方法检测法氏囊内是否存在IBDV，通过酶切鉴定(RFLP)确定存在于法氏囊内的病毒是否为W2512株，对存在非W2512株的法氏囊样品进行IBDV测序以确定其是否为攻毒所使用的vvIBDV。

1.8.4 体重变化 于28日龄和32日龄时对A1、B1、C1组逐只称重，比较增重变化。试验分组与处理情况见表1。

表1 试验分组及处理情况

-：不作处理； /：已无存活鸡

1.9 数据分析 应用EXCEL和GraphPad Prism 6.01软件对血清学检测结果进行统计和分析和检验，**P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 攻毒毒株的繁殖复壮和BID50测定 将IBDV超强毒株(vvIBDV)以点眼途径感染4周龄SPF鸡，72 h后，感染鸡法氏囊出现典型病变，表现为法氏囊周围有黄色胶胨状渗出物，如图1所示，计算病毒含量为104.80BID50/0.2mL。

图1 vvIBDV感染鸡法氏囊有黄色胶胨状渗出物

2.2 血清ELISA抗体测定

2.2.1 母源抗体检测 免疫前随机取1日龄试验鸡10只采血分离血清，分别用经典型和VP2专用试剂盒检测其母源抗体水平，结果显示，鸡群存在高且均匀的母源抗体，见表2。

表2 试验鸡IBD母源抗体ELISA检测结果

注：经典型试剂盒抗体效价≥396为阳性，VP2专用试剂盒抗体效价≥999为阳性

2.2.2 免疫后IBD抗体几何平均值(GMT)比较 利用经典型试剂盒检测结果显示，在22日龄和28日龄，各组鸡的IBD抗体水平无明显差异，在35日龄和42日龄，B组(囊胚宝组)的抗体水平明显高于A组(新流法组)和C组(未免疫组)(**P<0.01)，A组(新流法组)与C组(未免疫组)之间无差异，见图2。

图2使用经典型试剂盒检测IBDV抗体的结果

利用VP2专用试剂盒检测结果显示，在22日龄时，C组(未免疫组)的抗体水平明显高于A组(新流法组)和B组(囊胚宝组)(**P<0.01)；在28日龄时，A组(新流法组)的抗体水平和C组(未免疫组)相当，明显高于B组(囊胚宝组)(**P<0.01)；在35日龄时B组(囊胚宝组)的抗体水平明显高于A组(新流法组)后者又明显高于C组(未免疫组)(**P<0.01)；在42日龄时，仍然是B组(囊胚宝组)抗体水平最高，但是和A组(新流法组)差异不明显，两者皆明显高于C组(未免疫组)(**P<0.01)，见图3。

图3使用VP2专用试剂盒检测IBDV-VP2抗体的结果

2.2.3 攻毒后的法氏囊病变观察 攻毒后第4天进行剖检，结果可见A1组(新流法组)和C1组(未免疫组)法氏囊均出现大量纤维素样渗出，法氏囊颜色变黄；而B1组(囊胚宝组)法氏囊大小均匀，无明显渗出。

2.2.4 PCR检测和毒株鉴定结果 PCR/RFLP与测序结果显示，攻毒后第4天(32日龄)时A1组(新流法组)法氏囊9/10呈vvIBDV阳性；B1组(囊胚宝组)法氏囊10/10呈IBD W2512疫苗株阳性，同时未检测到其他IBDV；C1组(未免疫组)法氏囊10/10呈vvIBDV阳性，见表3。

表3 各攻毒组法氏囊PCR与测序检测结果

2.2.5 体重变化比较 分别于攻毒前和攻毒后 4 d 称重，结果显示，A1组(新流法组)和C1组(未免疫组)在攻毒后的增重差异不显著，两者皆明显低于B1组(囊胚宝组)，统计学(t检验)结果显示，两者之间的差异极显著，结果见表4。

表4 各攻毒组攻毒后4 d内的增重比较

**：显著性分析结果P<0.01，两组之间的差异极显著

3 讨论

在比较试验鸡群IBD抗体时，使用经典型试剂盒和VP2专用试剂盒的检测结果存在明显的差异。在检测35日龄和42日龄抗体时，使用经典型试剂盒检测新流法疫苗免疫组的抗体水平与未免疫组无明显差异。而使用VP2专用试剂盒检测时，新流法疫苗免疫组的抗体水平明显高于未免疫组。这可能与试验用的新流法疫苗仅含IBDV-VP2蛋白，不产生针对IBDV其他蛋白的抗体有关。本试验结果显示，有抗体的1日龄商品肉鸡免疫新流法疫苗后，使用经典型试剂盒检测出的抗体水平很低，22日龄后抗体平均滴度最高为461，若在田间检测结果远高于此可能意味着存在野毒感染。

一般白羽肉鸡对IBDV最易感的周龄为3～4周龄，所以本试验攻毒的时间确定为28日龄，保护力的高低直接反映疫苗早期的免疫效力。囊胚宝免疫组鸡群28日龄时的抗体水平较低，VP2专用试剂盒检测结果甚至低于新流法免疫组和对照组。但是攻毒保护结果显示，在该日龄对vvIBDV的保护力为100%，在鸡的法氏囊中全部并且仅检测到W2512疫苗毒。这说明尽管此时免疫鸡尚未产生较高的抗体，但通过W2512株在法氏囊占位、细胞免疫等效应产生了理想的保护力。在28日龄时，使用VP2专用试剂盒的检测新流法疫苗免疫组的抗体水平平均值为1 560，明显高于囊胚宝组。但攻毒保护结果显示，此时新流法疫苗免疫组对vvIBDV的保护力只有10%。也就是说使用新流法疫苗免疫的鸡群，尽管通过VP2专用试剂盒检测到1 560的平均抗体，但该水平的抗体对攻毒没有提供有效的保护，所以不能把VP2抗体阳性和保护力直接等同起来。在本试验中，对攻毒后4 d的增重进行了评估，新流法疫苗组增重和未免疫攻毒组没有显著差异，但和囊胚宝组增重有显著差异，再次充分说明囊胚宝疫苗免疫可以有效保护鸡只，而该新流法疫苗未能提供有效保护。

目前田间有一些商品肉鸡群在1日龄免疫新流法灭活疫苗，此外不再免疫其他任何IBD疫苗。目前确实没有发生大面积的IBD，这和我们在实验室研究的结果有些不符，解释这种现象的合理性可能有两种：(1)得益于良好的生物安全措施和长期使用优质IBD疫苗，场内没有vvIBDV存在；(2)场内存在以前免疫的IBD活疫苗的疫苗毒或其他IBD弱毒，起到了加强免疫的作用。

4 结论

用于1日龄有母源抗体鸡的免疫时，在试验中应用的新流法疫苗对vvIBDV的保护力不理想，通过1日龄免疫本试验中所用的新流法灭活疫苗来预防IBD存在很大风险。