利肺片对放射性肺炎小鼠肺部炎性因子及氧化应激指标的影响

张馨月，付世东

(陕西省延安市人民医院，陕西 延安 716000)

放射性肺炎是胸部放疗的最常见并发症之一，不及时有效治疗将不可逆发展为放射性肺纤维化，严重威胁患者生命安全。目前，临床对于放射性肺炎以大剂量糖皮质激素等药物治疗为主，但部分患者疗效不佳，且由于激素类药物不良反应过多，患者常无法耐受长期治疗[1-2]。因此，临床如何有效治疗放射性肺炎是医务工作者亟须解决的重大问题。利肺片具有驱痨补肺、镇咳祛痰等功效，广泛用于呼吸系统疾病的治疗[3-4]，但目前该药治疗放射性肺炎的探讨极少。为此，笔者观察了利肺片对放射性肺炎小鼠肺部炎性因子及氧化应激指标的影响，期望为该疾病的临床治疗提供一定的参考依据，现报道如下。

1 实验资料

1.1实验仪器与试剂 AS2016型组织包埋机(北京多得生物科技公司)，PO-7型电子显微镜(南京市第三精密仪器有限公司)，SH-KU-9型放射治疗机(上海特种医用器械厂)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-12(IL-12)检测所需试剂盒(武汉博士德公司)。苏木精-伊红(HE)及梅森(Masson)染色试剂盒与抗体(美国天地公司)。地塞米松(美国Sigma公司)，利肺片(北京同仁堂，国药准字Z11020023)。

1.2实验动物与分组 3月龄C57BL/6雌鼠(清洁级)60只，体质量18～21 g，购自西安交通大学基础医学院实验动物中心，并由该校药学院药理实验室代饲养，动物合格证编号：SCXK(陕)2016-1119。实验前对小鼠进行1周的适应性饲养，饲料饮水不限制，室温及自然光照。适应性喂养结束后将上述小鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组、利肺片高剂量组、利肺片中剂量组及利肺片低剂量组，每组10只。

1.3造模方法 参考文献[5]中方法，以10%水合氯醛麻醉各组小鼠，空白组麻醉后不进行放射；模型组及各给药组小鼠麻醉后取仰卧位，将其四肢绑于放射治疗床上，胸部曝露并屏蔽其他部位，采用放射机照射小鼠胸部前肢两腋窝中点，照射参数为36 MV光子，范围3.0 cm×1.8 cm，剂量18 Gy/次，1次/d，连续照射30 d。

1.4给药剂量与方法 根据文献[6]报道换算剂量，小鼠剂量(mg/kg)=12.3×成人剂量(mg/kg)，成人体质量按照60 kg计。根据地塞米松说明书人体给药剂量为12 mg/d，体质量以60 kg计，故小鼠剂量=12/60×12.3=2.46 mg/kg。根据利肺片说明书人体给药剂量为2.7 g/d，体质量以60 kg计，故小鼠剂量=2.7/60×12.3=0.55 g/kg，故选用0.55 g/kg作为中剂量，同时选用2倍剂量为高剂量(1.1 g/kg)，1/2倍剂量为低剂量(0.252 g/kg)。每天照射结束1 h后，地塞米松组给予地塞米松2.46 mg/kg灌胃，利肺片高、中、低剂量组分别给予利肺片1.1 g/kg、0.55 g/kg、0.252 g/kg灌胃，空白组及模型组仅灌胃等量生理盐水。

1.5标本采集与处理 最后一次给药结束8 h后，以颈椎脱臼法处死各组小鼠，开胸取双侧肺，将右侧肺均分为2份，以4%多聚甲醛固定，置于-20 ℃冰箱保存，将左侧肺以玻璃匀浆器制备成组织匀浆，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.6观察指标

1.6.1氧化应激及炎性因子指标检测 取制备好的肺组织匀浆，采用化学发光法检测氧化应激指标GSH-Px、SOD、CAT水平和炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12水平。

1.6.2肺组织病理观察 ①取小鼠一半右侧肺组织，包埋并切片，采用常规HE染色后利用光镜观察其病理变化情况，选择5个观察视野。通过观察肺泡炎面积与总视野面积的比例，并利用Szapiel半定量法[7]评价各组小鼠肺泡炎情况，其中无肺泡炎记1分；肺泡炎面积/总视野面积<0.2为轻度肺泡炎，记2分；20%≤肺泡炎面积/总视野面积<50%为中度肺泡炎，记3分；肺泡炎面积/总视野面积≥50%为重度肺泡炎，记4分。②取小鼠另一半右侧肺组织，包埋并切片，采用Masson试剂染色后利用光镜观察其肺部胶原染色情况，选择5个观察视野。采用Szapiel半定量法[7]评价各组小鼠肺部胶原沉积情况，其中无胶原沉积记1分；胶原沉积面积/总视野面积<20%为轻度胶原沉积，记2分；20%≤胶原沉积面积/总视野面积<50%为中度胶原沉积，记3分；胶原沉积面积/总视野面积≥50%总视野面积为重度胶原沉积，记4分。

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织匀浆中氧化应激指标水平比较 空白组、地塞米松组、利肺片各剂量组小鼠肺组织匀浆中GSH-Px、SOD、CAT水平均明显高于模型组(P均<0.05)，但地塞米松组及利肺片各剂量组上述各指标水平均明显低于空白组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺组织匀浆中氧化应激指标水平比较

注：①与模型组比较，P<0.05；②与空白组比较，P<0.05。

2.2各组小鼠肺组织匀浆中炎性因子指标水平比较 空白组、地塞米松组、利肺片各剂量组小鼠肺组织匀浆中IL-6、TNF-α、IL-12水平均明显低于模型组(P均<0.05)，但地塞米松组及利肺片各剂量组上述各指标水平均明显高于空白组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺组织匀浆中炎性因子指标水平比较

注：①与模型组比较，P<0.05；②与空白组比较，P<0.05。

2.3各组小鼠肺组织HE染色情况 空白组均无肺泡炎改变；模型组多为中度与重度肺泡炎改变，主要表现为中度及中度以上炎性细胞浸润；地塞米松组和利肺片各剂量组则多为轻度肺泡炎改变，主要表现为轻度及中度炎性细胞浸润。见图1。

2.4各组小鼠肺组织Masson染色情况 空白组中无胶原沉积；模型组主要为肺组织中度及重度胶原沉积改变；地塞米松组和利肺片各剂量组多为轻度胶原沉积改变。见图2。

图1 各组小鼠肺组织HE染色表现(×400)

2.5各组小鼠肺泡炎及胶原沉积评分比较 空白组、地塞米松组和利肺片各剂量组小鼠肺泡炎评分和胶原沉积评分均明显低于模型组(P均<0.05)，但地塞米松组和利肺片各剂量组肺泡炎评分和胶原沉积评分均明显高于空白组(P均<0.05)。见表3。

3 讨 论

放射性肺炎是由于肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、食管癌等胸部肿瘤经放射治疗后，在放射视野中患者正常的肺组织受到射线损伤而引起的一系列炎症反应[8-9]。炎症反应发生后，患者肺部组织凋亡途径与局部炎症级联效应被激活，局部氧化应激紊乱，上述作用均可加速肺部成纤维细胞的不断分裂与增殖，最终导致患者肺部出现大量胶原蛋白沉积，形成肺纤维化，严重威胁患者生命健康[10]。目前，临床对于该疾病的治疗尚无权威方法，主要为对症治疗，延缓疾病的进展。

图2 各组小鼠肺组织Masson染色表现(×400)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与空白组比较，P<0.05。

随着现代中医药研究的不断发展，中药治疗放射性肺炎的研究越来越多。利肺片主要由五味子、百合、冬虫夏草、枇杷叶、牡蛎、白芨、百部、甘草及蛤蚧等中药组成，主要用于气虚哮喘、咳痰、咯血、肺痨咳嗽及慢性气管炎等多种呼吸内科疾病的治疗。现代药理研究表明，五味子中多糖可有效阻止肺胶原蛋白沉积[11]；百合中甾体皂苷类化合物具有较好的抗炎活性，能够有效缓解肺部炎症反应[12]；枇杷叶中三帖酸则能够有效清除体内自由基，减轻机体氧化应激反应[13]。鉴于利肺片中主要成分具有一定的抗肺纤维化、抗炎及抗氧化应激活性[14]，故本研究探讨了该药物治疗放射性肺炎的价值。

既往研究表明，采用18 Gy的照射剂量对C57BL/6小鼠连续照射30 d后，小鼠可出现不同程度的放射性肺炎及肺纤维化改变，且该种小鼠放射后病死率较低，故是公认的放射性肺炎首选模型[15-16]。在本研究中，空白组不予放射给药，模型组仅进行放射不给药，能够分别反映出小鼠健康状态和放射性肺炎发病状态。此外，由于肺纤维化是放射性肺炎的主要阶段，随着放射性肺炎病情的发展，其可逐渐发展为肺纤维化，而肺纤维化发生后很难逆转。因此，本实验不仅采用HE染色观察小鼠肺泡炎情况，还利用Masson染色对小鼠肺纤维化情况进行了观察。而在放射性肺炎的病理变化中，射线可造成正常肺组织中产生大量活性氧自由基，造成DNA损伤及脂质过氧化，从而启动一系列炎性反应及细胞凋亡等基因活化的级联效应，最终进一步导致组织损伤，故测定照射后小鼠肺组织中氧化应激因子及炎性因子含量，能够有效反映药物对照射后小鼠肺组织细胞的保护作用。本实验结果表明，利肺片各剂量组小鼠肺组织匀浆中GSH-Px、SOD、CAT水平均明显高于模型组，IL-6、TNF-α、IL-12水平和肺泡炎评分、胶原沉积评分均明显低于模型组，提示利肺片可有效改善放射所致局部氧化应激紊乱，减轻肺部炎症反应，缓解肺纤维化，为利肺片治疗放射性肺炎提供了一定参考依据。