细胞间黏附分子-1和多聚免疫球蛋白受体在唾液腺上皮细胞中的表达及临床意义

黄 丽，孙传孔，彭若冰，刘志明，毛甜甜，彭友俭

(武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060)

干燥综合征属于一种慢性炎症性自身免疫性疾病, 其发病机制尚不明确，病变常累及唾液腺等部位[1]。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)参与免疫反应的发生及自身免疫的全过程，其在类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病中存在高表达[2]。多聚免疫球蛋白受体(pIgR) 为免疫球蛋白超家族中的一员, 是多聚免疫球蛋白A(pIgA) 和多聚免疫球蛋白M(pIgM) 的特异性受体[3-4]。目前针对ICAM-1和pIgR与干燥综合征关系的研究报道尚少。本研究旨在通过观察ICAM-1、pIgR在干燥综合征患者唾液腺上皮细胞中的表达情况，初步探讨ICAM-1、pIgR在干燥综合征发病中的作用。

1 临床资料

1.1一般资料 选择我院2016年9月—2017年3月收治的干燥综合征患者50例为研究组，均符合干燥综合征的诊断标准，排除合并肿瘤及心、脑等重要器官疾病者。其中男30例，女20例；年龄26～67 (38.2±2.1)岁。同时选择40例年龄、性别与研究组相匹配的健康体检者为对照组，男24例，女16例；年龄27～66 (37.8±1.6)岁。2组受试对象均自愿参加研究，并签署知情同意书。本研究方案经医院伦理委员会审核通过。

1.2研究方法

1.2.1唾液腺组织上皮细胞的收集及培养 在局部麻醉下,从受试对象的下唇黏膜处取出微小的唾液腺组织, 运用无菌磷酸缓冲液冲洗3次，切割成 1 mm3大小的小块。然后将每小块组织置于含有氢化可的松、青霉素、 链霉素、牛脑垂体提取物等无血清培养基中, 并于37 ℃、5% CO2条件下传代培养。当培养的唾液上皮细胞达到90 %融合后用于实验。

1.2.2ICAM-1、pIgR mRNA表达检测 采用RT-PCR法测定。以TRIzol试剂提取唾液腺上皮细胞中的总RNA。采用TAKAR公司反转录试剂盒，用提取和RNA来进行反转录合成cDNA，cDNA样品用PCR仪进行PCR扩增反应。引物设计由上海吉然生物科技有限公司完成。PCR扩增条件:首先94 ℃ 4 min 变性,继之94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环,最后延伸72 ℃ 10 min。反应结束后，取10 μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪采集照片并进行扫描，以β-actin为内参，分析ICAM-1、pIgR mRNA表达水平。

1.2.3ICAM-1、pIgR蛋白表达检测 采用链亲和素-生物素-免疫过氧化物酶法对唾液腺冰冻切片进行免疫组化分析。冰冻切片采用丙酮固定，加入鼠抗人pIgR或ICAM-1 单抗,在4 ℃条件下过夜。采用PBS 冲洗3次，每次5 min,滴入生物素化的兔抗鼠二抗,在室温下放置1 h。再用PBS冲洗3次，每次5 min,滴入辣根过氧化物酶标记的链亲和素，采用DAB显色，脱水，封片。200倍显微镜下采集照片，以棕褐色颗粒为阳性信号，结果采用Image J软件分析，计算光密度值(IOD)，以IOD/Area比值为相对表达量。

1.3统计学方法 数据应用SPSS 21.0统计软件进行分析。计量数据采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组唾液腺上皮细胞中ICAM-1mRNA、pIgR mRNA表达情况比较 研究组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 mRNA 表达水平明显高于对照组(P<0.05), pIgR mRNA 表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 mRNA和pIgR mRNA 表达量比较

注：①与对照组比较，P<0.05。

2.22组唾液腺上皮细胞中ICAM-1、pIgR蛋白表达情况比较 研究组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)， pIgR蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)，见表2及图1～4。

表2 2组唾液腺上皮细胞中ICAM-1和pIgR蛋白表达水平比较

注：①与对照组比较，P<0.05。

图1 对照组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 蛋白表达情况(×200)

3 讨 论

唾液腺上皮细胞的异常活化与干燥综合征炎症过程的发生及发展有关[5-6]，故积极探讨唾液腺上皮细胞中相关因子的表达情况对明确干燥综合征的发病机制有重要意义。淋巴细胞灶发生浸润是诱发局部免疫反应的一个重要表现[7-8]，而ICAM-1在炎症介导与机体免疫应答、淋巴细胞归巢等方面扮演着十分重要的角色[9]。本研究结果显示， 研究组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 mRNA 表达水平和ICAM-1 蛋白表达水平均明显高于对照组,提示干燥综合征患者存在ICAM-1高表达， ICAM-1可能使非淋巴细胞发生放大炎症反应，进而诱发干燥综合征炎症的发生。

图2 研究组唾液腺上皮细胞中ICAM-1 蛋白表达情况(×200)

图3 对照组唾液腺上皮细胞中pIgR蛋白表达情况(×200)

图4 研究组唾液腺上皮细胞中pIgR蛋白表达情况(×200)

pIgR基因全长19 kb,含有11 个外显子,位于染色体1q31- q41,启动子区有ISRE、AP-1、NF-κB 和类固醇激素等结合位点[10-11]。该基因编码693 个氨基酸, 蛋白分子量90～100 kD, 成熟片段100～120 kD。蛋白结构中有5 个Ig 样亚单位, 分为胞外区、跨膜区、胞内区[12]。pIgR介导多聚免疫球蛋白在上皮细胞内的转运，参与人唾液分泌型IgA (S-IgA)的形成。唾液中的游离SC即pIgR自身的裂解片断和S-IgA是口腔防御系统的组成成分，与龋病、牙周病、黏膜病等疾病密切相关。SC/pIgR是适应性免疫和先天性免疫应答的关键，一方面，它负责S-IgA的分泌，是S-IgA的组成成分之一，甚至转运已经侵入固有层的病毒或外来抗原，使机体有效地发挥黏膜适应性免疫防御作用；另一方面，游离SC也可能是非特异性免疫分子，参与机体先天性免疫防御[13]。但是多年来研究一直倾向于SC的主要作用是保护S-IgA不被水解酶降解，而忽略了游离SC/pIgR自身的免疫防御功能[14-15]。本研究结果显示，研究组唾液腺上皮细胞中pIgR mRNA 表达水平和pIgR蛋白表达水平均明显低于对照组,提示干燥综合征患者唾液腺可能由于pIgR的低表达而处于免疫活化状态。

综上所述，ICAM-1、pIgR 异常表达与干燥综合征密切相关，ICAM-1 高表达及pIgR 的低表达可能是诱发干燥综合征的一个重要发病机制。