电击法建立SD大鼠焦虑型心理应激-失眠模型的研究

张晓婷，刘文超，刘俊昌，，李明星，郭 蕾，卡热买提·阿布都克然木，张 赫，张新均

(1. 新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000；2. 新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐 830000)

心理应激是指出乎意料的紧张情况所引起的一种特殊的情绪状态，造成心理应激的应激源情绪包括焦虑、内疚、恐惧、抑郁等，其中最常见的是焦虑[1]。现代社会生活的高强度、快节奏造成了心理社会应激的增加，而焦虑型心理应激导致的负性情绪又是造成失眠的主要原因[2]。心理应激及失眠发病率的逐年增高，已成为威胁人类健康的重要原因。然而目前失眠发生机制尚不完全明确，临床治疗失眠的方法复杂多样且存在不同程度的不良反应。故建立一种理想的焦虑型心理应激-睡眠障碍动物模型，对于焦虑型失眠的研究有重要意义。啮齿类动物焦虑样行为与人类受累脑区相近，且人类抗焦虑药物可改善啮齿类动物行为学，说明啮齿类动物焦虑样行为的研究可以为人类的焦虑问题研究提供线索[3-4]。故本研究选择SD大鼠进行应激动物模型的建立评价，探讨其在科研领域的应用价值。

1 实验资料

1.1动物与分组 5周龄SPF级雄性SD大鼠26只，体质量180～220 g，新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2011-0004。实验动物群养在大鼠通风鼠笼中，每笼4～6只，实验于新疆医科大学动物实验中心内进行，饲养房温度20 ℃，湿度30%～60%，自由饮食，昼夜节律按照12 h明12 h暗进行。实验过程中对动物的处置谨遵我国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物适应性饲养3 d后，利用随机数字表法产生随机数，将26只大鼠随机分为模型组14只(考虑电击可能造成大鼠死亡，故适当加大样本量)和空白组12只。

1.2仪器与设备 电击笼(乌鲁木齐经科兴业生物科技有限公司制造)，大鼠通风鼠笼(新疆医科大学动物实验中心提供)，单向接触式交流调压器(浙江振凯电源设备有限公司)，艾普瑞电子式节能定时器(深圳市艾普瑞电子有限公司)，自制旷场实验敞箱(规格为 100 cm×100 cm×40 cm)，自制大鼠跳台实验相关仪器。

1.3实验方法 将模型组大鼠放入电击笼，每笼4～5只，除正常饲养外，采用不可逃避性足底电击方法建立焦虑型心理应激-失眠模型：选用25 V电压，通电与间歇1∶5的电击量，每天不定时剥夺大鼠睡眠时间2 h，共21 d；空白组大鼠正常饲养21 d，不做任何处理。

1.4观察指标

1.4.1体表特征及体质量 每日观察记录大鼠的精神状态、毛发、活动、体质量、等。

1.4.2自主活动试验 实验结束后对2组大鼠进行旷场实验。将实验敞箱置于隔音环境中，箱内面及底面均为黑色，底面平均分为25个4 cm×4 cm小方格，箱内温度为( 20±0.5)℃。中央区正上方安置摄像头，其视野能够覆盖整个敞箱内部。实验开始1 h前将大鼠搬进测试室适应环境，然后将大鼠放到实验敞箱中央区固定位置，每次放置头部固定朝向一侧。测量指标包括运动总距离、中央区停留时间、中央区进入次数、直立次数及理毛次数，随后用75% 乙醇清洁箱内环境，等乙醇挥发无味后再放入下一只。每只大鼠均进行7次测定，每次3 min，根据穿越底面积格子数计算水平得分，根据直立次数计算垂直得分，并记录修饰次数、排便次数。

1.4.3学习及记忆能力测试 旷场实验结束后对2组大鼠进行跳台实验。将2组大鼠逐一置于设有10 cm×10 cm绝缘平台的电击笼内，适应环境5 min，正式实验时电击笼被通以25 V交流电，受试大鼠受到电击后将寻找跳台来躲避电击。将大鼠置入电击笼内开始计时，大鼠跳到绝缘平台计时停止，该段时间为潜伏期；记录3 min内大鼠离开绝缘平台的次数为错误次数。

1.5统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。垂直得分、水平得分符合正态分布但方差不齐，排泄次数、修饰次数不符合正态分布，潜伏期数据不完全符合正态分布，故均采用两独立样本秩和检验，以M(Q1，Q3)形式表示；错误次数符合正态分布且方差齐，故采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组大鼠体表特征及体质量变化 2组大鼠实验前均精神状态良好，毛发白净柔顺有光泽，修饰行为次数适中，对刺激敏感，不易被激惹，排便次数适中。实验过程中，空白组大鼠体表特征无明显变化，体质量稳定增长；模型组2只大鼠咬导丝导致心搏骤停死亡脱落，其余大鼠全身皮毛疏松散乱、发黄干枯无光泽，眼色暗红，修饰次数明显增多，排便次数减少，并逐渐出现刺激过敏，警惕易惊、易激怒，好斗，相互追逐撕咬，且实验1，2，3周体质量均明显低于同期空白组(P均<0.05)。见表1。

2.22组大鼠自主活动检测情况 模型组大鼠垂直得分、水平得分均明显高于空白组(P均<0.05)，修饰次数明显多于空白组(P<0.05)，排泄次数2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2及表3。

表1 2组大鼠实验前后体质量比较

注：①与空白组比较，P<0.05。

表2 2组大鼠自主活动测试垂直得分、水平得分比较分)

注：①与空白组比较，P<0.05。

表3 2组大鼠自主活动测试排泄次数、修饰次数比较 次

注：①与空白组比较，P<0.05。

2.32组大鼠学习及记忆能力比较 模型组大鼠潜伏期明显长于空白组(P<0.05)，错误次数明显多于空白组(P<0.05)。见表4。

表4 2组大鼠学习及记忆能力测试中潜伏期、错误次数比较

注：①与空白组比较，P<0.05。

3 讨 论

人的一生有超过1/3的时间是在睡眠中度过的，睡眠对于动物包括人类的生命、生长具有不可或缺的重要生理意义。相关研究显示，成人睡眠每天不足4 h者，其病死率是每天睡眠7～8 h者的1.8倍[5]。动物研究显示，完全性睡眠剥夺可导致大鼠海马和皮质caspase-3表达增加，其增加程度与睡眠剥夺时间成正相关，而caspase-3表达增加被认为是引起大鼠神经元凋亡进而影响大鼠记忆和认知功能的重要机制之一[6]。

在医学发展史上，睡眠障碍一直是备受关注的课题，针对其发生机制的研究显示，心理应激导致的负性情绪，包括焦虑、抑郁等是造成失眠率不断增长的主要原因[7]，其公认的病理生理基础之一是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴) 过于兴奋和亢进[8]。然而目前还没有一种理想的焦虑型心理应激-睡眠障碍模型，为了方便今后对该类睡眠障碍的研究，本课题组设计了电击法建立SD大鼠焦虑型心理应激-失眠模型的实验。因为足底电击应激是经典应激方式的一种，广泛地应用于条件恐惧相关研究[9]，故本实验基于电刺激引起的大鼠足部疼痛，进而引起大鼠情绪焦虑，影响大鼠睡眠，而睡眠剥夺和情绪焦虑又可互为因果的生物行为模式，对大鼠进行间歇性低电压、不定时电刺激，另外根据大鼠昼伏夜出的生活节律[10]，电刺激选在白天进行。又因为绝大多数焦虑型睡眠障碍患者并非完全睡眠剥夺，而是睡眠时间不足，不能满足患者需求或睡眠时间颠倒，日常工作及生活受影响，为接近现实，故本实验设计为剥夺大鼠部分睡眠。该造模实验的优点：①电击大鼠足部制造大鼠失眠模型已经有相关研究基础作为支撑，确保了造模的有效性，而本实验的优势在于化繁为简，充分利用大鼠昼伏夜出的生活习性，进行不定时电刺激，大鼠在白天的任何时间段都有可能遭受电击，故而恐惧焦虑，无法安睡，减少了实验所需的人力物力，降低了造模成本。②单一的造模方法可以减少多因素干扰，控制了研究变量。③与药物造模相比，单纯的物理刺激不仅可以减少对实验动物机体的损害，还能控制化学反应可能对实验造成的误差，并且更为安全，更容易操作。另外本实验为了观察大鼠的行为变化和学习记忆能力，分别进行了旷场实验和跳台实验，其中旷场实验中动物行为发生的频率和持续时间可反映实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为[11-12]，跳台实验中潜伏期和错误次数可以反映实验动物的学习能力和记忆能力[13]。

本实验结果显示，模型组大鼠体质量增长缓慢，大鼠在新环境中的自主行为增多，表现出焦虑不安、烦躁犹豫的特征，这都与焦虑症的症状吻合；模型组大鼠排泄次数有减少，但与空白组相比差异无统计学意义，说明模型组与空白组大鼠在新环境下的紧张度相近，也可能与模型组大鼠因焦虑失眠导致的内分泌调节功能紊乱有关，还可能与样本量较小有关，需要进一步验证；但模型组大鼠修饰次数明显多于空白组，说明模型组大鼠在新环境下更容易出现焦虑情绪；模型组大鼠垂直得分、水平得分均明显高于空白组，但模型组垂直得分、水平得分标准差较大，说明个体之间存在较大差异，均数的代表性意义不强。跳台实验中，模型组大鼠潜伏期明显延长，错误次数明显增多，说明造模大鼠学习能力和记忆力下降，但模型组大鼠潜伏期标准差较大，说明个体之间存在较大差异，均数的代表性意义不强。

综上所述，电击法建立SD大鼠焦虑型心理应激-失眠模型方法简便、可靠、高效，可同时对多只大鼠进行模型建立，该造模方法可应用于探究焦虑型失眠的病因病机研究及判断焦虑型失眠的疗效。但由于多方面的原因，本实验设计还存在一些不足，如样本量较小；实验设备相对简陋，实验记录、统计、分析多数来自人工操作，主观性较强；实验没有在明、暗两种环境下进行，存在选择误差；焦虑反应和抑郁反应二者之间往往有一个时间跨度，在短时间的应激条件下动物以焦虑反应为主，而长时间的应激则会显著增加抑郁情绪的成分[14-15]，时间跨度不易掌握。在今后的焦虑型心理应激-失眠模型的研究中，可根据焦虑型失眠的流行病学特点，引入对雌性动物和幼年动物的研究；细化焦虑型心理应激-失眠的临床分型，有目标性的研制动物模型；对目前存在的造模方式进行系统评价，并进行改良优化，可提高模型制备实验的准确性、有效性和可重复性，从而为焦虑型心理应激-失眠相关研究提供可靠的动物模型。