microRNA-124高表达对甲状腺乳头状癌细胞系K1侵袭、迁移的影响及其机制

2018-08-31 04:39肖成华阚捷李海燕赞梅王新国
山东医药 2018年31期
关键词:癌基因划痕荧光素酶

肖成华,阚捷,李海燕,赞梅,王新国

(青海省人民医院,西宁810007)

甲状腺乳头状癌(TPC)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,约占内分泌肿瘤的95%,全球发病率逐年升高[1]。侵袭周围颈部组织及淋巴结转移等恶性生物学特征,严重影响PTC生存率[2]。探寻TPC侵袭、转移的具体分子机制,寻找预测TPC侵袭、转移的生物标记物及干预治疗靶点,对提高TPC患者的治愈率、生存率具有重要意义。微小RNA(MicroRNA)能够与mRNA的3′非编码区(3′-UTR)特异性结合,降解mRNA或者抑制其翻译[3]。MicroRNA参与调节细胞增殖、分化、凋亡和侵袭等细胞进程[4]。近年研究[5]证实,microRNA-124是一种重要的抑癌基因,在胃癌、肝癌等多种肿瘤细胞中表达降低或表达丢失。在前列腺癌组织中microRNA-124可抑制TGF-α介导的上皮间充质转化(EMT)。外源性增加microRNA-124表达可抑制结直肠癌细胞的侵袭、迁移[6]。但TPC细胞中microRNA-124的功能、分子机制及其内在的细胞靶向分子并未被完全阐明。含IQ基元GTP酶激活蛋白1(IQGAP1)是一种在细胞内广泛表达的细胞骨架蛋白,含有多个蛋白相互作用结构域,能够与细胞黏附分子、细胞骨架成分以及多种信号通路蛋白相互作用,参与调节细胞运动、细胞形态、细胞周期等细胞功能。2017年1月~2018年1月,我们观察了microRNA-124高表达对TPC细胞系K1侵袭、迁移的影响,并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 TPC细胞系K1、BCPAP、TPC-1及正常甲状腺细胞系Nthy-ori3-1来自中国上海科学院细胞库。DMEM培养基(含10% 胎牛血清)中培养,置于37 ℃,5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司,microRNA-124 mimics(促进microRNA-124表达)及microRNA无关序列(microRNA-124 NC)来自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1细胞microRNA-124检测方法 采用Real-time PCR法。取适量K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1细胞,TRIzol法提取细胞总RNA,测定RNA浓度及纯度后,将RNA反转录,-80 ℃冰箱保存备用。microRNA-124上下游引物分别为5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′;5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′,以GAPDH为内参,上下游引物分别为5′-TCTCTGCTCCTCCTGTT-3′;5′-ACTCCGACCTTCACCTT-3′。K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1细胞microRNA-124的相对表达量分别为1.05±0.06、2.31±0.11、1.65±0.09、3.48±0.12,与Nthy-ori3-1比较, K1、BCPAP、TPC-1 microRNA-124相对表达量均降低(P均<0.05);PTC细胞系中,K1的microRNA-124相对表达量最低,因此选择K1细胞进行后续实验。

1.3 K1细胞培养、分组及和转染方法 取4×104个处于对数生长期的K1细胞,接种于3.5 cm培养皿中,培养24 h,将细胞分为观察组、对照组、空白组,观察组、对照组采用脂质体Lipofectamine 3000分别转染microRNA-124 mimics、microRNA-124 NC,操作步骤均参照试剂说明书严格进行。空白组不做任何处理。

1.4 K1细胞侵袭情况观察 采用Transwell试验。取适量两组细胞,将Matrigel基质胶从-80 ℃冰箱中取出,4 ℃冰箱过夜融化。DMEM无血清培养液稀释Matrigel基质胶至浓度为4.0 μg/μL,取50 μL加入至Transwell小室,放置6 h;凝固后取150 μL的细胞悬液(细胞总数约1×105个)至Transwell小室中,在下室中加入500 μL DMEM培养液;培养48 h后,取出Transwell小室,棉签擦去Transwell小室内的细胞,0.1%结晶紫溶液对Transwell小室多孔膜下表面的细胞进行染色,蒸馏水洗涤后,显微镜下观察两组细胞侵袭情况,随机选取3个视野,记录每个视野的细胞数目,取平均值为侵袭细胞数。

1.5 K1细胞迁移情况观察 采用细胞划痕试验。以6×105/孔的密度,将对数生长期两组细胞接种于6孔板中,细胞汇合度为80%~90%时,用移液器枪头垂直于底部均匀划线,每孔至少划3条平行线;PBS缓冲液洗涤,去除划下细胞,加入无血清培养基,显微镜下拍照观察,培养24 h再次置于显微镜下拍照观察,计算细胞划痕24 h的划痕愈合百分比。愈合百分比=(1-24 h划痕间距/0 h划痕间距)×100%,取平均值。

1.6 K1细胞IQGAP1 mRNA及microRNA-124检测 采用Real-time PCR法。取对数生长期两组细胞,TRIzol法提取细胞总RNA,将RNA进行反转录,-80 ℃保存备用。microRNA-124及GAPDH的引物序列见“1.3”,IQGAP1上下游引物分别为5′-AGAACGTGGCTTATGAGTACCT-3′;5′-CCAGTCGCCTTGTATCTGGT-3′。以2-ΔΔCt表示IQGAP1 mRNA及microRNA-124的相对表达量。

1.7 K1细胞IQGAP1 蛋白检测 采用Western blotting法。取对数生长期两组细胞。RIPA蛋白裂解液抽提细胞全蛋白,检测蛋白浓度,-80 ℃保存备用。SDS-PAGE胶分离蛋白,湿法将蛋白转至PVDF膜上,脱脂奶粉封闭,加入兔抗人IQGAP1多克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体,室温孵育1 h,加入HRP标记的羊抗兔二抗,室温孵育1 h,加ECL发光液进行化学发光显影,凝胶成像仪对蛋白条带进行观察,计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8 K1细胞中含有IQGAP1基因3′UTR报告质粒的荧光素酶活性检测 采用荧光素酶报告基因试验。将IQGAP1基因3′-UTR片段克隆至pGL3-Basic载体,构建pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR报告基因质粒,参照脂质体转染说明书的操作步骤,将microRNA-124 mimics/NC、报pGL3-Basic- IQGAP1-3′-UTR(pGL3-Basic空载体为对照)、内参质粒pRL-SV40共转染至K1细胞。培养48 h参照双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书的操作步骤,检测两组荧光素酶活性。计算pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR报告基因质粒的相对荧光素酶活性,即萤火虫荧光素酶活性与内参海肾荧光素酶的活性的比值。实验重复3次,取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞侵袭数比较 培养24 h时观察组、对照组、空白组细胞侵袭数分别为(104.32±11.21)、(304.27±20.83) 、(299.38±18.32)个,观察组细胞侵袭数低于对照组和空白组(P均<0.05)。

2.2 各组细胞划痕愈合百分比比较 培养24 h时观察组、对照组、空白组细胞迁移数分别为(62.16±3.21)、(104.27±6.83)、(99.38±5.32),观察组划痕愈合百分比低于对照组和空白组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞IQGAP1 mRNA及蛋白 、microRNA-124 相对表达量比较 见表1。

表1 各组细胞IQGAP1 mRNA及蛋白 、microRNA-124相对表达量比较

注:与对照组比较,#P均<0.05;与空白组比较,*P<0.05。

2.4 各组基因质粒的相对荧光素酶活性比较 培养48 h观察组、对照组、空白组基因质粒的相对荧光素酶活性分别为0.24±0.06、1.06±0.15、1.10±0.17, 观察组相对荧光素酶活性低于对照组和空白组(P均<0.05)。

3 讨论

microRNA参与调控约60%的蛋白编码基因,而microRNA表达紊乱可导致糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病的发生。近年来,大量研究[7]结果表明,在肿瘤发生发展过程中,microRNA发挥着类似抑癌基因或者促癌基因的功能,肝细胞癌中microRNA-337参与调节PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路活性,并可调节HMGA2基因表达,促进恶性进展,发挥促癌基因功能,而microRNA-425可抑制肿瘤细胞侵袭迁移,在鼻咽癌中发挥抑癌基因功能。TPC细胞中存在多种microRNA的表达异常,如microRNA-363-3p在TPC肿瘤组织和细胞株中的表达水平均降低,发挥抑癌基因功能[8],而microRNA-96[9]等则可促进TPC肿瘤细胞增殖、侵袭等恶性进展过程,发挥促癌基因功能。然而microRNA在TPC发生发展过程中的内在分子机制尚不十分明确。探寻microRNA在TPC中的作用机制,有利于更深层次的认知TPC,并且为TPC的诊断和治疗提供新靶点。

MicroRNA-124在结直肠癌、肝癌、胃癌以及甲状腺癌中表达显著下降,Zhang等[10]研究结果表明, microRNA-124通过阻滞PRRX1基因表达,增强结直肠癌细胞的放疗敏感性。MicroRNA-124作为一种抑癌基因,其异常表达与肿瘤密切相关,如在乳腺癌和非小细胞肺癌中,microRNA-124参与并且促进了肿瘤的恶性进展,可以作为肿瘤患者不良预后的生物标记物。microRNA-124可以抑制肿瘤细胞发生侵袭转移,如在肺癌细胞中,microRNA-124靶向抑制MYO10基因表达[11],在膀胱癌细胞中,microRNA-124能够靶向调节R℃K1基因表达,降低细胞侵袭迁移能力。

本研究结果发现,microRNA-124在TPC细胞系中相对表达量均低于正常甲状腺细胞系,提示microRNA-124表达下降可能参与并促进了TPC的肿瘤形成过程,且可能发挥抑癌基因功能,Zhang 等[12]在膀胱癌细胞HT1197 中增加microRNA-124表达后,导致其体外成瘤速率下降。本研究结果表明,外源性增加microRNA-124表达后,K1细胞的侵袭和迁移能力均显著下降,其他研究者在胃癌细胞、神经胶质瘤细胞中促进microRNA-124的表达后,肿瘤细胞的侵袭和迁移能力均降低,共同证实microRNA-124可发挥抑癌基因功能,抑制TPC肿瘤细胞侵袭、迁移等恶性生物学活性。

microRNA-124的靶基因有STAT3、EZH2等,在细胞增殖、凋亡和侵袭迁移等过程中发挥作用。而microRNA-124通过何种途径影响TPC细胞侵袭迁移过程,尚无报道。本研究结果发现,在K1细胞中增加microRNA-124表达后,细胞内IQGAP1的mRNA及蛋白水平均降低,初步推测IQGAP1可能是microRNA-124的下游靶基因,进一步地,双荧光素酶报告基因试验结果显示,microRNA-124能够降低pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR报告基因质粒的荧光素酶活性,证实microRNA-124可特异性靶向抑制IQGAP1基因表达。

IQGAP1能够结合一些在肿瘤发生发展中有重要作用的蛋白,如Rac1、Cdc42,激活Wnt/β-catenin、MAPK信号通路,最终促进肿瘤发生发展、侵袭迁移,导致患者预后不良[13]。IQGAP1可以直接与E-cadherin结合,抑制E-cadherin的功能,减弱细胞之间的黏附作用,促进TPC细胞的侵袭、迁移[14]。本研究中,外源性增加K1细胞中microRNA-124表达后,导致细胞的侵袭和迁移能力下降,可能是microRNA-124通过下调IQGAP1基因表达,抑制其参与各种信号通路和EMT过程所致。MicroRNA-124参与调控众多靶基因,本研究并未对IQGAP1以外的基因表达情况进行检测,虽然在其他肿瘤中,有大量关于IQGAP1参与调控侵袭迁移的机制研究,但尚未在TPC中有过研究报道,所以本研究中发现的microRNA-124在TPC中的作用机制,还需要进一步的探究。

综上所述,microRNA-124高表达可抑制K1细胞的侵袭、迁移,其机制可能为microRNA-124下调IQGAP1表达。

猜你喜欢
癌基因划痕荧光素酶
NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证
富马酸卢帕他定治疗皮肤划痕症的疗效观察
不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响
基于微观划痕的疲劳强度预测
重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达
冰上芭蕾等
腺病毒载体介导的抑癌基因LRIG1对PC-3细胞生物学特性的影响
探讨抑癌基因FHIT在皮肤血管瘤中的表达意义
抑癌基因WWOX在口腔肿瘤的研究进展