丹皮酚抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞TNF-α释放对共培养体系中血管平滑肌细胞凋亡及p38 MAPK信号通路的影响

刘雅蓉, 吴鸿飞，戴 敏

(1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2. 新安医学教育部重点实验室， 安徽 合肥 230038；3. 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230012)

在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生发展过程中，血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)的炎性损伤和功能障碍是AS形成的始动环节[1]。细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为微生物感染的主要致病因素能够刺激内皮损伤，是公认的致内皮损伤的危险因子之一[2]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是构成血管壁另一重要组成成分，其凋亡参与AS及再狭窄的发生发展[3]。p38 MAPK信号通路在调控细胞凋亡方面发挥着重要的作用[4]，其下游蛋白中p53和caspase-3与细胞凋亡有着密切的关系[5]。本课题组已有研究表明LPS可以诱导与VSMCs共培养的VECs黏附功能改变[6]，但是LPS对VECs的炎症损伤是否会影响VSMCs的正常功能及其机制尚不知晓。

丹皮酚(Paeonol，Pae)是从毛茛科植物牡丹PaeoniaSuffruticoasAndr.的干燥根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根及根茎中提取出来的有效成分之一。前期的研究已证实Pae可以抑制ox-LDL诱导的VECs中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)释放，减少VECs的炎性反应[7-8]，并且可以明显降低由LPS诱导的PI3K/AKT-NF-κB通路[9]，发挥保护内皮损伤的作用。而Pae对VECs炎性反应的抑制作用是否会影响VSMCs凋亡还需进一步验证。本实验以VSMCs凋亡为切入点，阐明Pae抗AS作用的分子机制，为研究Pae治疗AS提供新的靶点。

1 材料

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，清洁级，体质量(160±10)g，安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(皖)2016-0015]提供。

1.2 主要药物与试剂 Pae：宣城百草植物工贸有限公司，纯度99%；LPS：美国Sigma公司；Transwell小室：美国Gibco公司，孔径：0.4 μm；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒：上海贝博生物试剂；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)ELISA试剂盒：美国Biosource公司；鼠抗β-actin抗体(批号 AP0065)、兔抗MKK3/6抗体(批号 BS1784)、兔抗P-MKK3/6抗体(批号 BS1225)、兔抗p38抗体(批号 BS6412)、兔抗P-p38抗体(批号 BS1689)、兔抗p53抗体(批号 BS3746)、兔抗caspase-3抗体(批号 BS3723)：Bioworld Technology公司。

1.3 主要仪器 MCO-175型CO2培养箱：日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型洁净工作台：苏净集团安泰公司；CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司；ELX800uv酶标仪：Bio-TEK公司；Hoefer电泳仪：Amersham Biosciences公司。

2 方法

2.1 大鼠胸主动脉VECs及VSMCs的分离、培养与鉴定 参照文献[10-13]的方法进行操作。取大鼠胸主动脉，将血管外翻，暴露内膜，血管两端扎紧，0.25% Ⅰ型胶原酶消化1 h，切成2 mm×2 mm的小块，保持血管内膜朝下，贴在鼠尾胶原包被过的细胞培养瓶底部，放入细胞培养箱培养。另取大鼠胸主动脉血管，同样操作使血管内膜暴露出来，用刀片小心地自上而下刮1～2遍，以去除血管内皮细胞，露出中膜层，0.3% Ⅰ型胶原酶消化1 h，切成2 mm×2 mm小块，保持中膜层朝下，贴在细胞培养瓶底部，放入细胞培养箱培养。待细胞融合率达到约80%的时候，即可进行细胞传代，在原代细胞第一次传代时，采用差速消化、差速贴壁法纯化细胞。本实验所采用的细胞均是3～5代细胞。采用免疫细胞化学法鉴定VECs胞浆内Ⅷ因子相关抗原以及VSMCs胞浆内α-SMA的表达，确定分离出的细胞确实为VECs以及VSMCs。

2.2 VECs和VSMCs共培养模型的复制 借助Transwell小室建立共培养体系，无菌条件下，将VECs(1×105/mL)接种于6孔板底部，另取空白孔放上Transwell小室，将VSMCs(1×105/mL)接种在Transwell小室中，待两种细胞均贴壁生长后，吸弃原培养基，将Transwell小室移到种有VECs的孔中，重新加入DMEM(含15% FBS)，建立起共培养体系，两种细胞间不发生直接细胞连接，VECs主要是通过分泌因子透过Transwell膜影响VSMCs。

2.3 MTT检测LPS损伤作用及Pae保护作用的量效时效关系 将VECs细胞混悬液(1×105/mL)接种于96孔板中培养，每孔加入含有不同浓度的LPS(1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)培养液200 μL，另设不含LPS的培养液为正常对照组，分别于培养箱中培养不同时间(1、3、5、7、9 h)。每孔分别加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培养箱中培养4 h后，小心吸弃上清细胞培养液，加入150 μL DMSO溶解MTT，振荡器混匀，酶标仪490 nm测定吸光度(absorbance, A)值。细胞抑制率=(正常对照组A值-实验组A值)/正常对照组A值×100%。

另取细胞，每孔预先给予含不同浓度(7.5、15、30、60、120 μmol/L)Pae的培养液200 μL，分别于培养箱中培养不同时间(6、12、24、36、48 h)。吸弃原培养液，PBS轻洗1次，每孔加入含LPS(100 ng/mL)的培养液200 μL继续孵育7 h。另设单加培养液为正常对照组。同样方式检测A值。细胞存活率=实验组A值/正常对照组A值×100%。

2.4 实验分组及给药 建立共培养体系，进行分组干预。①正常对照组：用DMEM(含2% FBS)培养细胞；②LPS组：用含LPS(100 ng/mL)的培养液孵育7 h；③Pae(15、30、60 μmol/L)组：预先用含15、30、60 μmol/L Pae的培养液孵育24 h，吸弃培养液，再分别加入含LPS(100 ng/mL)的培养液孵育7 h；④TNF-α抑制剂组：先加入含10 μg/mL TNF-α抑制剂的培养液孵育24 h，吸弃培养液，再加入含LPS(100 ng/mL)的培养液孵育7 h；⑤SB203580组：先加入含20 μmol/L SB203580的培养液孵育2 h，吸弃培养液，再加入含LPS(100 ng/mL)的培养液孵育7 h。

2.5 ELISA法检测TNF-α 吸取各组细胞上清液备用。将标准品按规定浓度依次稀释；加样：空白对照孔只加显色剂和终止液，标准品孔加入50 μL标准品、50 μL链霉素-HRP，待测样品孔加入各细胞上清液样品40 μL、抗TNF-α抗体10 μL、链霉亲和素-HRP 50 μL。每组样品设置3个复孔，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育60 min。经过洗涤、显色及终止反应后，采用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的A值，根据标准品A值绘制标准曲线，计算样品浓度。

2.6 流式细胞仪检测VSMCs凋亡率 收集各组细胞培养液，各组细胞加入500 μL不含EDTA的胰酶，于培养箱中消化50 s，1 800 r/min离心5 min，弃去培养液。加入预冷PBS重新混悬细胞，1 800 r/min离心5 min，弃去PBS，重复两次。加入400 μL Annexin Ⅴ结合液混悬细胞(1×106/mL)，在细胞混悬液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，轻轻混匀后于2～8 ℃避光条件下孵育15 min，再加入10 μL PI染色液后轻轻混匀，于2～8 ℃避光条件下孵育5 min，立即用流式细胞仪检测。流式细胞仪激发光波长为488 nm，FL1通道检测Annexin Ⅴ-FITC的绿色荧光信号，PI红色荧光在620 nm，通过FL3通道检测。

2.7 Western blotting检测蛋白变化 提取各组细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉常温封闭4 h后，用PBST洗涤3遍，每次10 min。将硝酸纤维素膜放入一抗稀释液稀释的一抗中，4 ℃孵育过夜。用PBST洗3遍，每次10 min。加入脱脂奶粉稀释的二抗IgG-HRP，室温孵育2 h。用PBST洗3遍，每次10 min。用化学发光试剂(ECL)显影，凝胶成像系统采集图片。

3 结果

3.1 LPS损伤VECs的量效时效关系 不同浓度的LPS作用不同时间，对VECs有不同程度的损伤。在浓度为100 ng/mL，刺激时间为7 h时，LPS对VECs的抑制率最大(P<0.05)，故选择该浓度和作用时间作为最佳刺激浓度和时间。见图1。

注：与正常对照组(LPS 0 ng/mL组)比较，*P<0.05

3.2 Pae对LPS损伤的VECs保护作用的量效、时效关系 LPS作用后，各组VECs存活率均有显著降低(P<0.05)；不同浓度Pae作用不同时间，对LPS(100 ng/mL)诱导损伤的VECs均具有不同程度的保护作用。其中15、30、60 μmol/L Pae作用24 h对VECs损伤的保护作用最为明显，设为Pae最佳作用浓度及最佳作用时间。见图2。

3.3 Pae抑制LPS损伤的VECs分泌TNF-α 与正常对照组相比，LPS显著提高VECs分泌的TNF-α水平(P<0.05)；给予15 μmol/L Pae预保护的细胞，与LPS刺激组相比，TNF-α水平显著降低(P<0.05)；给予30、60 μmol/L Pae预保护的细胞，与LPS刺激组相比，TNF-α水平均显著降低(P<0.05)。见图3。表明LPS可诱导VECs释放TNF-α，而Pae可显著抑制VECs中TNF-α的释放。

注：与正常对照组[Pae(-)、LPS(-)组]比较，*P<0.05；与LPS组[Pae(-)、LPS(+)组]比较，#P<0.05

注：与正常对照组[Pae(-)、LPS(-)组]比较，*P<0.05；与LPS组[Pae(-)、LPS(+)组]比较，#P<0.05

3.4 Pae抑制共培养体系中VSMCs的凋亡 LPS组与正常对照组相比，VSMCs的凋亡率显著上升(P<0.05)；Pae各剂量组与LPS组相比，VSMCs的凋亡率均显著降低(P<0.05)，且呈现浓度依赖性，说明Pae可显著抑制VSMCs的凋亡；TNF-α抑制剂组与LPS组比，VSMCs的凋亡率明显降低(P<0.05)，说明共培养体系中TNF-α水平降低会导致VSMCs的凋亡受抑制。见图4。

注：与正常对照组[Pae(-)、LPS(-)、TNF-α抑制剂(-)组]比较，*P<0.05；与LPS组[Pae(-)、LPS(+)、TNF-α抑制剂(-)组]比较，#P<0.05

3.5 VECs与VSMCs共培养体系的建立 VSMCs单培养LPS组与正常对照组比较，VSMCs凋亡率显著上升(P<0.05)；VECs-VSMCs共培养LPS组与VSMCs单培养LPS组比较，VSMCs凋亡显著上升(P<0.05)；VSMCs单培养Pae组VSMCs凋亡率显著低于VSMCs单培养LPS组(P<0.05)；VECs-VSMCs共培养Pae组VSMCs凋亡率显著低于VSMCs单培养Pae组(P<0.05)。见图5。说明VECs-VSMCs共培养时Pae对VSMCs凋亡的抑制作用比VSMCs单培养时更明显，证实Pae可能通过影响VECs而间接抑制VSMCs的凋亡，同时也验证共培养体系的建立成功，VECs与VSMCs之间存在相互作用。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与VSMCs单培养LPS组比较，#P<0.05；与VSMCs单培养Pae组比较，△P<0.05；A.正常对照组；B. VSMCs单培养LPS组；C. VECs-VSMCs共培养LPS组；D. VSMCs单培养Pae组；E. VECs-VSMCs共培养Pae组

3.6 Pae抑制共培养体系中VSMCs p38 MAPK通路及凋亡效应蛋白表达 从图6A和6B中可见，LPS组与正常对照组比较，p-MKK3/6、p-p38、p53和活化的caspase-3蛋白水平显著增加(P<0.05)，

说明LPS可以诱导共培养体系中VSMCs p38 MAPK信号通路和凋亡相关蛋白的激活。Pae作用后各蛋白水平显著降低(P<0.05)，且呈现一定的浓度依赖性，说明Pae可以抑制LPS诱导的VSMCs p38 MAPK信号通路和凋亡相关蛋白的激活。TNF-α抑制剂组与LPS组比较，各蛋白水平均显著下降(P<0.05)，说明共培养体系中TNF-α水平下降会导致VSMCs的凋亡减少。从图6C中可见，p38 MAPK通路抑制剂SB203580组与LPS组比较，凋亡相关蛋白p53和活化的caspase-3水平均显著下降(P<0.05)，说明p38 MAPK通路抑制会导致VSMCs的凋亡减少。由此得出结论：Pae通过减少VECs中TNF-α的分泌，抑制与其共培养的VSMCs p38 MAPK信号通路，降低凋亡相关蛋白水平，最终抑制VSMCs凋亡。

4 讨论

VECs功能失调和损伤是AS形成的始动环节，LPS作为微生物感染的主要致病因素，在VECs损伤以及AS的病变形成中起重要作用。本实验中，正常的VECs在显微镜下为短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，边界清晰，呈典型的单层铺路石样镶嵌排列。LPS刺激后，显微镜下可见细胞形态出现梭形改变，长宽比明显增加，变为成纤维细胞状，细胞皱缩，细胞内形成空泡，细胞间裂隙明显加宽，MTT结果显示细胞存活率显著降低；而预先给予Pae保护后，再加入LPS刺激VECs，显微镜下观察细胞形态未发生明显改变，并且细胞存活率与LPS组相比显著增加。有报道显示，LPS可以与细胞膜上的受体结合，诱导VECs释放多种细胞因子和炎性递质。在LPS损伤的人脐静脉内皮细胞中，ICAM-1水平上升，促使单核细胞聚集黏附并迁移至血管壁或血管外间隙，同时释放蛋白酶类和氧自由基，致使组织损伤[14]。本实验结果显示，LPS可以显著刺激VECs中TNF-α的分泌，而Pae能有效保护LPS所致的VECs炎性损伤。

注:与正常对照组[Pae(-)、LPS(-)、TNF-α抑制剂或SB203580(-)组]比较,*P<0.05;与LPS组[Pae(-)、LPS(+)、TNF-α抑制剂或SB203580(-)组]比较,#P<0.05;A. TNF-α抑制剂对p38 MAPK通路蛋白表达的影响及Pae的干预作用;B. TNF-α抑制剂对凋亡效应蛋白表达的影响及Pae的干预作用;C. p38 MAPK通路抑制剂对凋亡效应蛋白表达的影响及Pae的干预作用图6 Pae抑制VSMCs p38 MAPK通路及凋亡效应蛋白表达(x±s,n=3)

VSMCs是构成血管壁的重要组成成分，其凋亡的发生与AS的发生发展密切相关。VSMCs凋亡使粥样斑块中纤维帽细胞数量减少，间质胶原纤维合成减少，斑块稳定性下降，易发生破裂，导致心血管事件发生。在AS斑块处的VECs、巨噬细胞和T淋巴细胞由于炎性反应和免疫作用会产生各种炎性因子，诱导VSMCs凋亡[15]。本实验结果显示：LPS损伤的VECs将释放炎性因子TNF-α，加入TNF-α抑制剂以后，体系中TNF-α被结合，阻断了其与细胞表面TNF受体的结合，降低TNF-α活性，VSMCs的凋亡率便有显著下降，说明VSMCs凋亡与VECs释放的TNF-α密切相关。Pae预保护后，可以减少VECs分泌的TNF-α，从而使得VSMCs中凋亡相关蛋白表达减少，凋亡率下降。

为了最大程度地模拟体内细胞结构，观察VECs与VSMCs之间的相互作用，笔者采用膜孔径为0.4 μm的Transwell小室建立VECs与VSMCs共培养模型。有报道显示，共培养中VECs主要通过分泌各种细胞因子影响VSMCs的生长[16-17]。本实验在Transwell膜上室培养VSMCs，下室培养VECs，研究VECs分泌炎性因子TNF-α，对上室VSMCs凋亡的影响。从本实验结果可以看出，LPS作用后，VECs-VSMCs共培养中VSMCs的凋亡率显著高于单培养VSMCs；Pae作用后，VECs-VSMCs共培养中VSMCs的凋亡率明显低于单培养VSMCs，说明共培养体系建立成功，VECs与VSMCs间存在相互作用，影响VSMCs的凋亡。因此也证实Pae可以通过保护损伤的VECs，减少其释放TNF-α，间接抑制VSMCs的凋亡。

p38 MAPK信号通路是哺乳动物MAPK信号通路中一条经典途径，通过多级激酶的级联反应把细胞外信号向细胞内传递，在调控细胞凋亡方面发挥重要的作用。其级联反应需要3个关键激酶：MAPKKK，MAPKK(MKK3和MKK6)以及MAPK。因此本实验检测p-MKK3/6及p-p38蛋白的相对表达水平，以此来反映p38 MAPK信号通路的活性。激活p38 MAPK信号通路的因素有紫外线、促炎因子(TNF-α、IL-1)、缺血/再灌注、高渗环境、热损伤、LPS、抗肿瘤药物、生理应激等[18]，这些因素通过激活MAPKKK，随后激活MKK3/6，最终使p38被激活[19]。p38 MAPK信号通路诱导下游蛋白p53活化，调节与凋亡相关的基因，引起细胞凋亡效应因子caspase-3发生结构变化，切割某些重要蛋白质，引起细胞凋亡。caspase-3是最重要的凋亡效应因子，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路蛋白[20]。正常状况下，caspase-3以无活性的procaspase-3形式存在，当细胞接受凋亡刺激时，它被剪切为cleaved caspase-3而变为活性形式，进而诱导细胞凋亡。本研究结果显示：Pae作用后，减少LPS诱导的VECs分泌TNF-α水平，VSMCs中p38 MAPK信号通路受到抑制，p-p53、cleaved caspase-3蛋白水平降低，VSMCs凋亡率明显降低。

综上所述，Pae减少VECs炎性分泌的作用将会影响VSMCs中p38 MAPK信号通路，最终抑制其凋亡。