新藤黄酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

苏婧婧，侯 梅，李庆林，程 卉

(安徽中医药大学科研实验中心 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

胃癌是临床常见的癌症之一[1]，且发病率连续攀升，居恶性肿瘤第4位，病死率居恶性肿瘤第2位，是危害人类身体健康的重大疾病之一[2]。目前，胃癌的治疗主要依靠手术治疗、化学治疗及其他治疗。胃癌早期无明显症状，易被忽略，一般发现时已处于晚期[3-4]，因此急需探索治疗胃癌的新方法[5]。

新藤黄酸(gambogenic acid，GNA)作为中药藤黄的活性成分之一，具有抗癌谱广、毒性低等特点。近年来，本课题组对GNA的抗肿瘤作用进行了一系列研究，研究表明GNA对多种肿瘤增殖有良好的抑制作用，如人胶质瘤细胞U251、非小细胞肺癌细胞A549、人鼻咽癌细胞CNE-1、人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞HepG-2[6-12]，而人胃癌SGC-7901细胞对GNA的敏感性尚未见报道，故笔者就此展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料 GNA(纯度99.0%，批号 20170503)：安徽中医药大学药学院自制；抗体β-actin、p53和Caspase-9：美国CST公司；胎牛血清(fetal bovine saline,FBS)：美国Gibco公司；ECL发光试剂盒：美国Thermo公司；Western blot试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号 041718160925)：碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养 胃癌SGC-7901细胞：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，细胞在含10% FBS的DMEM培养液中培养。并于5% CO2、 37 ℃的恒温恒湿培养箱中培养，待密度长至60%～70%，进行后续实验。

1.3 细胞形态变化 将SGC-7901细胞制备成单细胞悬液，调整细胞数至1×106/mL，接种于6孔板。待细胞完全贴壁，加入含GNA(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μmol/L)的培养基，空白对照组(0 μmol/L GNA)为含10% FBS的完全培养基培养等量细胞，在条件培养箱中培养24 h后观察并拍照。

1.4 MTT实验 将SGC-7901单细胞悬液接种于96孔板，每孔180 μL(每孔1×104细胞)，待细胞完全贴壁，加入含GNA(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)的新鲜培养基，阴性对照组为含与实验组等量细胞的细胞悬液，条件培养箱中培养24 h后，按照试剂盒的要求，配制5 mg/mL的MTT母液，每孔加入20 μL MTT后，于细胞培养箱继续孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，适当混匀，37 ℃培养箱再继续孵育4 h，待紫色结晶物完全溶解，采用多功能全波长酶标仪于570 nm处测定光密度(optical density, OD)。细胞存活率=处理组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.5 流式细胞术检测SGC-7901细胞凋亡率 将SGC-7901单细胞悬液接种于6孔板，待细胞完全贴壁，加入含GNA(2.0、4.0、8.0 μmol/L)的新鲜培养基后继续培养。作用24 h后，用0.25%胰酶消化细胞(不含EDTA)，细胞浓度调整为(0.5～1.0)×106/mL，1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS轻轻重悬，洗涤离心2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液混匀，先后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI染液轻轻混匀。室温避光孵育10～20 min，上流式细胞仪，检测凋亡率。

1.6 Western blot检测凋亡相关蛋白变化 收集总蛋白样品，为确保上样量一致，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。收集的蛋白样品加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，充分变性。冷却到室温，上层10%～15%分离胶使用40～60 V恒压电泳，溴酚蓝进入下层5%浓缩胶时使用120 V恒压电泳，目的蛋白适当分离后停止电泳。使用恒定电流200 mA电泳蛋白1.5～2 h，4 ℃转膜槽放置在冰浴中，转移至硝酸纤维素膜。水平摇床1% BSA室温封闭1 h，回收封闭液，Western洗涤液(PBST)洗涤，加入适合比例的一抗工作液，4 ℃水平摇床孵育过夜。回收一抗，加入PBST洗涤液，水平摇床洗涤3次，每次10 min。辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温孵育2 h，回收二抗，加入PBST洗涤液，水平摇床洗涤3次，每次10 min。采用ECL发光试剂盒(自行配置显色液)检测蛋白表达水平，Protein Simple Alpha凝胶成像系统记录图片并分析。

2 结果

2.1 GNA对SGC-7901细胞生长的抑制作用 MTT法检测结果表明，1.0～32.0 μmol/L GNA处理SGC-7901细胞24 h后，与对照组(0 μmol/L GNA)比较，细胞存活率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。GNA作用SGC-7901细胞24 h后IC50为4.673 μmol/L。见图1。

注：与0 μmol/L GNA组比较，*P<0.05

2.2 GNA对SGC-7901细胞形态的影响 不同浓度GNA作用24 h后，倒置显微镜下观察SGC-7901细胞形态。2.0、4.0 μmol/L GNA组细胞部分体积变小，皱缩变圆，少量细胞呈半贴壁悬浮状态。随着GNA浓度的增加，悬浮于培养液中的脱落细胞增多。见图2。

2.3 GNA对SGC-7901细胞凋亡率的影响 不同浓度GNA作用24 h后，均能诱导细胞发生凋亡，与对照组比较，各给药组凋亡率增加，且随着GNA浓度的增加，细胞的凋亡率逐渐增加。见图3。

注：A. 0 μmol/L GNA组；B.2.0 μmol/L GNA组；C. 4.0 μmol/L GNA组；D. 8.0 μmol/L GNA组

图2 倒置显微镜下观察GNA对SGC-7901细胞形态的影响(10×10倍)

注：A. 0 μmol/L GNA组；B. 2.0 μmol/L GNA组；C. 4.0 μmol/L GNA组；D. 8.0 μmol/L GNA组

图3 GNA对SGC-7901细胞凋亡的影响

2.4 GNA对SGC-7901细胞内p53和Caspase-9表达水平的影响 不同浓度GNA作用SGC-7901细胞24 h后，与0 μmol/L GNA组比较，4.0、8.0 μmol/L GNA组SGC-7901细胞内p53和Caspase-9蛋白表达显著上调(P<0.05)，且随着GNA浓度的增加蛋白表达水平逐渐增加。见图4。

3 讨论

本研究观察一定浓度梯度(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)GNA作用24 h对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。MTT结果表明，GNA对胃癌SGC-7901细胞增殖有抑制作用，且具有浓度依赖性。

流式细胞仪检测发现，与空白对照组(0 μmol/L GNA组)相比，不同浓度GNA处理胃癌SGC-7901细胞24 h后，细胞凋亡率会随着GNA浓度的增加而上升，2.0 μmol/L组细胞凋亡率变化不明显；与空白对照组相比，4.0、8.0 μmol/L组的细胞凋亡率明显增加。

Western blotting实验表明，与空白对照组相比，不同浓度GNA处理胃癌SGC-7901细胞24 h后，p53和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平会随着GNA浓度的增加而上调，2.0 μmol/L组p53蛋白表达水平变化不明显；与空白对照组相比，4.0、8.0 μmol/L组p53蛋白表达水平明显上调。与空白对照组相比，GNA组Cleaved Caspase-9蛋白表达水平均有明显升高。

细胞凋亡涉及细胞形态和生化特征的变化，如细胞体积缩小，核固缩，DNA片段化和凋亡小体的形成。p53基因作为肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控，介导细胞凋亡的发生，Caspase-9作为一种半胱氨酸蛋白酶，参与细胞凋亡的起始。有报道表明细胞凋亡的异常是癌症发生的重要指标之一[13]，诱导细胞凋亡可用于肿瘤的治疗，许多抗肿瘤药物均能引起肿瘤细胞凋亡。

本研究发现，GNA能抑制人胃癌SGC-7901细胞生长和增殖，其机制与GNA诱导细胞凋亡有关。通过本研究以期能为GNA抗肿瘤机制的进一步研究提供实验依据，也为GNA开发为临床抗肿瘤药物提供实验基础。

注：与0 μmol/L GNA组比较，*P<0.05