胃液转流对急性坏死性胰腺炎大鼠血钙和肿瘤坏死因子—α的影响

方勇木

【摘要】 目的：探讨胃液转流对急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠血清钙和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法：将雄性SD大鼠72只按照随机数字表法分为急性坏死性胰腺炎组（ANP组）、胃液转流组（GB组）和对照组（SO组），每组分12、24 h两个时间点，每个时间点12只。以5%牛磺脱氧胆酸钠逆行胰胆管注射建立ANP模型，GB组在造模前30 min行胃空肠吻合完成胃液转流。观察各组血清钙浓度，采用蛋白免疫印迹技术（Western blot）分析血清TNF-α变化。结果：ANP组各时间点血清钙浓度较SO组均显著下降（P<0.01）。GB组血清TNF-α浓度较ANP组显著下调（P<0.01），血清钙浓度较ANP组显著升高（P<0.01）。结论：行胃液转流人为旷置十二指肠，结果ANP大鼠的低钙血症回升，血清炎症细胞因子TNF-α明显下降。

【关键词】 急性坏死性胰腺炎； 胃液转流； 低钙血症； 肿瘤坏死因子-α

【Abstract】 Objective：To investigate the role of gastric bypass in hypocalcaemia and TNF-α of rats with ANP.Method：A total of 72 male health adult SD rats were randomized into three groups：ANP group，ANP treated with Gastric bypass group （GB group），sham operation group（SO group）.Every group was sub-divided into 12，24 h group with 12 rats in each one.ANP model was induced by bili-pancreatic duct retrograde infusion with 5% sodium taurocholate solution.In the GB group，rats were accomplished with Gastric bypass 30 minutes before the induction of ANP model.The Serum calcium was determined，the change of TNF-α was measured by Western blot.Result：The serum levels of calcium in ANP group was lower than that in SO group（P<0.01）.The expression TNF-αin GB group was lower than that in ANP group（P<0.01），the serum levels of calcium was higher than that in ANP group（P<0.01）.Conclusion：The gastric bypass increases the serum levels of calcium and decreases the expression of TNF-α of rats with ANP.

【Key words】 Acute necrotizing pancreatitis； Gastric bypass； Hypocalcaemia； TNF-α

First-authors address：The Third Hospital of Xiamen，Xiamen 361100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.007

本实验通过制作急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠模型，应用胃液转流人为旷置十二指肠，干预ANP大鼠，研究胃液转流对ANP大鼠低钙血症和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 成年雄性SD大鼠72只，体重250～270 g，按照随机数字表法分为3组，急性坏死性胰腺炎（ANP组）、胃液转流组（GB组）和对照组（SO组），每组分为制模后12、24 h两个时间点，每个时间点重复12只大鼠。

1.2 方法 （1）参照Schmidt等[1]和杨波等[2]方法建立ANP动物模型：大鼠制模前12 h禁食，不限制饮水，大鼠经腹腔内注射10%水合氯醛（2 mL/kg）麻醉，固定，腹部皮肤备皮，消毒，自上腹正中剑突下1 cm作约1 cm切口进腹，于肝下找到十二指肠，胆胰管肝门端用动脉夹夹闭，显微镜下操作，将一连接微量推注泵的4?头皮针头从胆胰管远端逆行穿刺，以0.2 mL/min注射速度逆行推注5%牛磺脱氧胆酸钠（1.0 mL/kg），保持压力8 min，注毕即可观察到胰腺组织广泛水肿和出血。回纳十二指肠，逐层关腹。大鼠后肢皮下注射生理盐水10 mL以防脱水。（2）GB组在泵入5%牛磺脱氧胆酸钠前30 min完成胃液转流术：取十二指肠与小肠交界处以下5 cm处与胃大弯侧前壁行侧侧吻合，吻合口直径0.5 cm，胃与十二指肠交界处交锁缝合，缝闭胃流出道，其他步骤同ANP组。（3）SO组在开腹后，只轻翻动胃、十二指肠、空肠及胰腺后关腹。（4）标本收集：各组大鼠在相应时间点分别再次麻醉、消毒后开腹，下腔静脉采血8 mL，血液凝固析出血清后，离心分离（3 000 r/min，10 min），测定血清钙浓度。

1.3 观察指标 （1）血清钙浓度的测定采用全自动生化检测仪检测。（2）蛋白免疫印迹技术（western blot）检测血清TNF-α表达量。应用蛋白提取试剂盒（Pierce公司）按照说明书进行蛋白提取，Bradford法进行蛋白定量（试剂盒购自TIANGEN公司），按说明书进行蛋白定量，取20 μg样品常规进行电泳、转膜，用5%脱脂奶粉封闭，加入TNF-α、β-actin一抗（1∶400，TIANGEN公司）孵育过夜，洗膜后加入羊抗鼠IgM二抗，于室温孵育45 min，洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂，压片显影，采用Bandscan软件分析图像，目的条带与β-actin的比值表示各組蛋白质表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，应用单因素方差分析、t检验和秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清钙浓度变化比较 SO组中12 h时间点血清钙浓度与24 h时间点血清钙浓度比较，差异无统计学意义（P>0.01）。ANP组各时间点血清钙浓度均较SO组显著下降，GB组在各时间点血清钙浓度均较ANP组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 三组血清TNF-α变化比较 SO组各时间点血清TNF-α不表达。GB组各时间点TNF-α的表达量较均ANP组显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01），见表2和图1、2。

3 讨论

SAP早期免疫过激，多种细胞因子的大量释放是SAP病情恶化的重要因素之一[3]。細胞因子和炎症介质在SAP发病过程中起十分重要的病理、生理作用已为共识。细胞因子的释放情况与病情严重程度及并发症的发生存在密切相关性。在SAP早期由于胰酶的异常激活，导致单核巨噬细胞的过度激活并且释放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子，炎性细胞因子可刺激粒细胞使之活化并与内皮细胞黏附，且进一步刺激吞噬细胞使其功能激活，释放大量氧自由基（OFR）及过量炎性介质、蛋白酶和水解酶，从而产生瀑布样炎症反应，导致全身炎症反应综合征（SIRS）的发生，造成器官损害，进一步发展为多器官功能障碍综合征（MODS）。低钙血症是重症急性胰腺炎（SAP）常见的重要并发症，血清钙水平的高低与预后密切相关，低血钙程度与病情严重程度成正比。血钙水平已成为临床诊治中判断预后、估计病情的最重要指标之一。临床上观察到，当SIRS表现不明显时，血清钙不降低或降低不明显；相反，SIRS表现突出伴有胰外脏器功能不全时，即使胰周脂肪坏死不显著，血钙也显著降低。血钙的降低幅度与SIRS的严重程度成正比[4]。因此血钙水平与细胞因子和炎症介质的表达量，均反应SAP病情的严重程度，Yekebas及其研究小组进行了一系列动物实验研究，证实早期有效的清除炎症介质，可改善实验SAP猪的预后[5-7]，Dunn等[8]通过阻止NF-kappa B的活化、抑制细胞因子TNF基因的表达，减轻SAP炎症反应，改善SAP预后。SAP早期应用抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（TNF-α McAb）阻断TNF-α的表达，在改善胰腺病理变化、降低血淀粉酶的同时也改善了血钙水平[9]。

因此通过抑制细胞因子和炎症介质的生成，可减轻SAP的炎症反应，降低SAP血钙水平，改善SAP的预后。

促胰液素是刺激胰液分泌的最强刺激物，而十二指肠的pH值是促胰液素释放的最主要因素，生理性的胃酸即可引起血中促胰液素的升高，pH值4.5为阈值；流入十二指肠的胃酸促进促胰液素酶的释放，是胰腺外分泌增加的主要因素，由于十二指肠酸性化，在胰酶分泌增加的同时，血中胆囊收缩素亦升高，胃酸不仅促进促胰液素酶的释放，也促进胆囊收缩素的释放；抑制胃酸的分泌能抑制促胰液素的释放，间接抑制胰液的分泌[10-12]。文献[13-15]的研究结果表明注盐酸入十二指肠能强烈刺激促胰液素的释放，使胰酶分泌增加；陈元方[16]研究表明，酸化十二指肠可引起胰蛋白酶分泌量增可，两者呈量效关系，酸化十二指肠可引起胆囊收缩素（CCK）分泌量增加，CCK的增加量与进入十二指的酸量呈正相关。SAP时，胰腺外分泌受刺激增强，胰蛋白酶大量分泌，加重胰腺自身消化，包括胰周组织的消化及胰外器官损害加重，引起病情恶化，理论上胰腺外分泌减少，胰蛋白酶减少，减少胰腺自身消化，进而减轻急性胰腺炎炎症程度，“胰腺休息”理论是SAP治疗的基础，即减少和抑制胰腺的外分泌，尽可能地减轻胰液对胰腺和胰周组织的损伤。多数学者研究证实，旷置胃和十二指肠减少胃酸分泌和反射性调节机制是保证胰腺休息的重要因素[17]，临床上发现SAP时经空肠内营养不但不增加胰腺的负担，反而减少肠源性感染的并发症，增强机体的抵抗力[18-19]。有研究报道，完成胃空肠吻合术行胃液转流的SD大鼠，其含脂肪的组织TNF-α mRNA水平较对照组明显下降[20]。屈新才等[21]报道对于需要手术治疗的急性胰腺炎并发十二指肠梗阻患者，行迷走神经干切断加胃空肠吻合取得良好的疗效。

本实验通过行胃液转流，人为旷置十二指肠，使得胃酸、胃蛋白酶等胃液不经过十二指肠，去除了胃液对十二指肠的直接刺激，使胃液直接进入空肠，此方式去除了胃液胃酸对十二指肠的直接刺激，结果ANP大鼠的低钙血症回升，血清炎症细胞因子TNF-α明显下降。因此笔者推测胃液转流可能可减少促胰液素及胆囊收缩素释放，使胰液特别是胰蛋白酶分泌及细胞因子释放减少，减轻SAP的炎症反应，改善SAP的预后，其中具体机制及能否减轻急性胰腺炎的炎症程度和能否改善急性坏死性胰腺炎的预后，值得进一步深入探讨。

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