乏氧诱导因子—1α在不可手术宫颈癌中表达水平与放化疗效果的相关性研究

谢福川 邵汛帆 张弛 肖伟

【摘要】 目的：探究乏氧誘导因子-1α（HIF-1α）的表达水平与不可手术宫颈癌患者放化疗后短期、长期预后的关联性。方法：选取本院2012年6月-2015年6月收治的不可手术并接受放化疗综合治疗措施的宫颈癌患者134例，通过特异性HIF-1α抗体检测癌组织内HIF-1α的表达情况，将其分为HIF-1α表达（-）组和HIF-1α表达（+）组，两组患者均于放化疗后4周予以短期疗效评判；然后随访2年，统计患者局部控制率与生存率，分析评估HIF-1α的表达水平对放化疗后短期及长期预后的影响。结果：134例的不可手术的宫颈癌患者中，HIF-1α表达（-）者共35例（26.1%），包括Ⅱ期19例、Ⅲ期12例、IVa期4例；HIF-1α表达（+）者共99例（73.9%），包括Ⅱ期47例、Ⅲ期37例、IVa期15例。短期疗效分析显示：HIF-1α表达（-）组肿瘤治疗有效率为91.4%（32/35），明显高于HIF-1α表达（+）组的79.8%（79/99）（字2=7.24，P<0.05）。长期疗效分析：HIF-1α表达（-）组2年局控率为88.6%（31/35）高于HIF-1α表达（+）组的75.8%（75/99）（字2=4.892，P<0.05）；HIF-1α表达（-）组2年生存率为94.3%，明显高于HIF-1α表达（+）组的78.8%（字2=6.134，P<0.05）。结论：HIF-1α的表达水平与不可手术宫颈癌放化疗短期、长期疗效之间存在关联性；HIF-1α表达（-）的患者接受放化疗后，短期有效率、2年局控率、2年生存率均高于HIF-1α表达（+）的患者；因此HIF-1α可考虑作为不可手术宫颈癌患者疗效预测的生物标志物之一。

【关键词】 HIF-1α； 宫颈癌； 放疗； 化疗； 关联性分析

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between the expression level of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α） and short-term and long-term prognosis of patients with inoperable cervical cancer after radiochemotherapy.Method：A total of 134 patients with cervical cancer who were treated with radiotherapy and chemotherapy were enrolled in our hospital from June 2012 to June 2015.The expression of HIF-1α in cancer tissues was detected by specific HIF-1α antibody，the patients were divided into two groups：HIF-1α（-） group and HIF-1α（+） group.Both groups were evaluated short-term after 4 weeks of radiotherapy and chemotherapy.Then，the local control rate and survival rate were analyzed，and the effect of HIF-1α expression on the short-term and long-term prognosis after radiotherapy and chemotherapy was analyzed and evaluated.Result：Totally 35 cases（26.1%） had HIF-1α expression （-） in 134 cases of unresectable cervical cancer，including 19 cases of stage Ⅱ，12 cases of stage Ⅲ and 4 cases of stage IVa.The expression of HIF-1α expression （+）99 cases（73.9%），including 47 cases of stage Ⅱ，37 cases of stage Ⅲ and 15 cases of stage IVa.Short-term curative effect analysis showed that the effective rate of tumor treatment in the HIF-1 α expression（-） group was 91.4%（32/35），which was significantly higher than 79.8%（79/99） in the HIF-1α expression（+）group（字2=7.24，P<0.05）.Long-term therapeutic analysis：the 2-year local control rate was 88.61%（31/35）in the HIF-1α expression（-） group，which was higher than 79.8%（75/99） in the HIF-1α expression（+）group（字2=4.892，P<0.05）；the 2-year survival rate of HIF-1α expression（-） group was 94.3%，which was significantly higher than 78.8% of HIF-1 α expression（+） group（字2=6.134，P<0.05）.Conclusion：There is a correlation between the expression level of HIF-1α and the short-term and long-term curative effect of radiotherapy and chemotherapy for inoperable cervical cancer.Short-term effective rate，2-year local control rate，2-year survival rates were higher than those with HIF-1α expression （+）；therefore，HIF-1α could be considered as one of the biomarkers for predicting the efficacy of inoperable cervical cancer.

【Key words】 HIF-1α； Cervical cancer； Radiotherapy； Chemotherapy； Correlation analysis

First-authors address：Huizhou Municipal Center Hospital，Huizhou 516001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.004

宫颈癌是我国女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计结果显示，宫颈癌发生率仅次于乳腺癌，且逐年上升，发病年龄呈现年轻化趋势[1]。宫颈癌发生与人乳头状病毒感染、性生活紊乱、环境污染、过早妊娠等原因存在密切联系，但其发病机制尚未完全阐明[2]。目前，临床上针对早期宫颈癌以根治性手术切除为主，对于无法进行手术的晚期患者（即不可手术宫颈癌患者）则采用放疗联合化疗进行治疗[3-4]。宫颈癌晚期患者由于肿瘤细胞倍增时间短，相关供血血管生长速度无法满足瘤体生长需要，容易导致瘤体内部相对供血不足，从而使肿瘤细胞处于相对缺血、缺氧状态[5]。细胞乏氧促进HIF-1α表达水平升高，其羟基化抑制被解除，随后与乏氧反应受体结合，从而激活乏氧反应和启动相关保护性基因的转录、表达[6]。据研究报道，HIF-1α能够对血管内皮生长因子（VEGF）、红细胞生成素（EPO）的表达水平进行特异性调控，进而影响肿瘤组织能量代谢、血管生成、癌细胞增殖和侵袭，最终促进肿瘤发展[7-9]。因此，HIF-1α对恶性肿瘤发展和乏氧耐受具有较强的促进作用。同时，HIF-1α的表达水平与肿瘤组织的分级存在密切联系，且对肿瘤治疗的疗效及预后有一定的指示作用。目前，关于宫颈癌不可手术阶段HIF-1α的表达情况研究尚少，因此，本研究以不可手术宫颈癌患者为研究对象，探究HIF-1α的表达水平与放化疗后短期、长期预后情况的关联性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院肿瘤放疗科2012年6月-2015年6月收治的不可手术宫颈癌患者共134例，患者年龄29～67岁，平均（45.1±10.8）岁。按2009年FIGO分期[10]，134例患者中Ⅱ期66例、Ⅲ期49例、Ⅳa期19例。按癌细胞组织学分类，包括宫颈鳞癌130例、腺癌2例以及鳞腺癌2例。纳入标准：（1）均为不可手术宫颈癌患者；（2）宫颈活检前均未接受放疗或化疗干预，无合并其他系统恶性肿瘤病史；（3）每例患者临床资料详细，随访资料完整；（4）所有标本均有两个以上专业病理医师确诊；（5）患者KPS评分≥70分，放化疗前所有肝肾功能、血象等相关指标均在正常值范围。排除标准：（1）患者年龄>70岁；（2）初治即出现远处器官转移；（3）哺乳期或妊娠妇女。该研究已经医院伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 将宫颈活检组织于4%中性多聚甲醛中固定48 h，而后浸泡于70%酒精过夜。按以下步骤进行脱水包埋：80%酒精浸泡2 h，90%酒精浸泡2 h，100%酒精浸泡1 h（中途更换一次酒精），二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡25 min，石蜡Ⅰ、Ⅱ各浸泡45 min。常规包埋后切片，厚度5 μm，65 ℃烤箱过夜。切片于室温平衡30 min后，常规脱蜡、水化。0.01 M、pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液进行修复，高火2 min加热至沸腾，低火维持10 min后，自然冷却。于每个组织切片上滴加过氧化物酶阻断剂10 min（室温），PBS洗3次，5 min/次。5%BSA封闭液室温封闭1 h，而后HIF-1α抗体（Abcam，1∶200）稀释液4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，15 min/次，而后选用生物素标记的二抗稀释液室温孵育2 h。每张切片滴加链霉菌抗生物素-过氧化氢溶液进行反应，室温孵育10 min，而后DAB显影液进行显影。常规染核，梯度脱水，封片。

1.2.2 治疗与随访 所有患者均接受同步化疗+盆腔内外照射放疗，患者于外照射放疗第1天给予顺铂40 mg/m2同步化疗，每7天一个疗程，共6个疗程；盆腔外照射采用6MV-X线，等中心照射，上界定于第四至五腰椎水平，下界位于闭孔下缘，两侧外界位于真骨盆外1.5～2.0 cm，根据肿瘤分期进行外照射范围调整，体外全盆腔照射DT：26～30 Gy/13～15 f，中间挡铅后推量宫旁剂量DT：50 Gy/25 f，第3周开始行Ir192腔内照射，A点剂量5 Gy/次，1次/周，共6～7次，总剂量DT 30～35 Gy，后装治疗当日不给予外照射治疗。放化疗综合治疗结束后第4周予以复查妇科查体、腹部超声、盆腔MR、胸部X线片、PET-CT等评判短期疗效。放化疗综合治疗结束后予以电话、门诊随访2年，统计患者局控率与生存率。

1.2.3 治疗效果判定 按照RECIST实体瘤标准进行疗效评价[11]，完全缓解（CR）：所有目标病灶消失；部分缓解（PR）：目标病灶长径总和至少退缩30%；疾病进展（PD）：目标病灶长径总和至少增加20%或出现新病灶；疾病稳定（SD）：目标病灶变化介于PR和PD标准之间。短期治疗有效率=（CR+PR）/总例数×100%；长期疗效：2年局控率=（CR+PR+SD）/总例数×100%；2年生存率：生存时间从治疗第1天开始计算至24个月或死亡为止，以月为计算单位。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 HIF-1α表达情况 根据免疫组织化学检测结果显示，HIF-1α表达（+）染色大部分为棕色、棕褐色，多数分布于宫颈癌组织细胞核内。134例患者，其中HIF-1α表达（-）者共35例（26.1%），包括Ⅱ期19例、Ⅲ期12例、IVa期4例；HIF-1α表达（+）者共99例（73.9%），包括Ⅱ期47例、Ⅲ期37例、IVa期15例，见图1。HIF-1α表达（-）组与HIF-1α表达（+）组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 短期疗效 针对所有不可手术宫颈癌患者（Ⅱ期+Ⅲ期+IVa期）进行整体研究，数据分析结果显示，所有HIF-1α表达（-）组肿瘤治疗有效率为91.4%（32/35），高于HIF-1α表达（+）组的79.8%（79/99），差异有统计学意义（字2=7.24，P<0.05）。针对所有患者中的不同分期进行亚组分析，结果显示，Ⅱ期患者中HIF-1α表达（-）组肿瘤治疗有效率为94.7%，高于HIF-1α表达（+）组的83.0%，差异有统计学意义（字2=4.750，P<0.05）。Ⅲ期患者中HIF-1α表达（-）组肿瘤治疗有效率为91.7%，高于HIF-1α表达（+）组的78.4%，差异有统计学意义（字2=7.982，P<0.05）。IVa期患者中HIF-1α表达（-）组肿瘤治疗有效率为75.0%，HIF-1α表达（+）组肿瘤治疗有效率为73.3%，两组比较差异无统计学意义（字2=1.745，P>0.05）。见表1。

2.3 远期疗效 对134例患者进行为期2年的门诊、电话随访，其中局部复发28例，死亡23例。所有不可手术宫颈癌患者中，HIF-1α表达（-）组2年局控率为88.6%，高于HIF-1α表达（+）组的75.8%，差异有统计学意义（字2=4.892，P<0.05）；HIF-1α表达（-）组2年生存率为94.3%，高于HIF-1α表达（+）组的78.8%，差异有统计学意义（字2=6.134，P<0.05）。见表3。

3 讨论

乏氧诱导因子（HIF-1）最初被发现于乏氧肝细胞株Hep3B细胞提取物中，是细胞或组织对乏氧环境产生的一种保护蛋白。HIF-1包括α和β两个亚基，HIF-1α是HIF-1蛋白的重要调节亚基，决定HIF-1蛋白的活性，且对微环境氧气浓度的敏感度较高，当氧浓度含量较高时，HIF-1α启动体内泛素化程序对HIF-1蛋白进行降解；当细胞处于乏氧状态时，HIF-1α促使HIF-1结构稳定，从而细胞内HIF-1表达水平升高；β亚基来源于芳香烃受体核异位子家族，可能与稳定HIF及其二聚化有关[12-13]。肿瘤组织内细胞呈现高度增殖状态，导致微循环供血相对不足，细胞处于相对缺氧环境，因此肿瘤组织内HIF-1表达水平高于正常组织。有研究报道，肿瘤组织高表达HIF-1有利于维持肿瘤组织高能量代谢，促进新血管生成，促进肿瘤细胞的增殖与转移[14]。近年来有研究发现，HIF-1α与人类多种肿瘤的发生发展存在密切联系，肿瘤组织内部缺氧抑或是抑癌基因突变或癌基因激活均会导致细胞内HIF-1α表达水平升高；高表达的HIF-1α进一步促进一系列基因的转录翻译，导致肿瘤细胞耐受乏氧，促进癌细胞的增殖与转移，最终推动肿瘤进程[15-17]。除了细胞缺氧刺激以外，抑癌基因（p53、VHL、PTEN等）的突变以及原癌基因的过度激活均会导致HIF-1表达水平升高，从而通过HIF-1信号通路改变肿瘤细胞的生物学特性[18]。通过HIF-1信号通路，可以有效调节下游相关基因的转录与翻译，这些基因通常涉及细胞的能量代谢、离子代谢、血管生成和收缩调节。受HIF-1调节的基因主要包括促红细胞生成素、血管内皮生长因子、糖酵解酶以及与肿瘤增殖和凋亡相关的蛋白。由于HIF-1α的中心环节效应，这些因子发生了一系列的變化，最终导致新的血管生成，使肿瘤细胞适应低氧微环境，并促使肿瘤细胞进一步生长和扩散[19-21]。由此可见，肿瘤组织HIF-1α表达水平越高，肿瘤分化程度越低，癌细胞增殖及侵袭能力越强。因此，HIF-1α有望成为肿瘤患者接受放化疗治疗后疗效评定、远期预后预测的生物标志物。

国内外许多学者已经对HIF-1α在不同的肿瘤组织中的表达情况进行探索，研究发现肺癌、大肠癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中均存在较高水平的HIF-1α表达，甚至在一些癌前病变的组织内也存在HIF-1α的高水平表达。然而，目前尚缺乏HIF-1α在宫颈癌领域中表达水平与治疗效果的关联性研究。因此，本文以不可手术宫颈癌患者为研究对象，探究HIF-1α的表达水平与放化疗后近期、远期预后情况的相关性。研究数据显示，针对整体病例（Ⅱ期+Ⅲ期+IVa期）进行统计学分析发现，HIF-1α表达（-）组在接受同步放化疗后肿瘤治疗有效率（91.4%）高于表达（+）组（79.8%），差异有统计学意义（P<0.05），HIF-1α表达（-）组2年局控率88.6%（31/35）高于HIF-1α表达（+）组75.8%（75/99），差异有统计学意义（P<0.05）；HIF-1α表达（-）组2年生存率94.3%（33/35）高于表达（+）组78.8%（78/99），差异有统计学意义（P<0.05）。但是在针对Ⅱ、Ⅲ、IVa期患者中HIF-1α表达（-）、（+）组治疗有效率进行分层分析发现，Ⅱ、Ⅲ期两者比较差异有统计学意义（P<0.05），但IVa期未达到显著统计学意义标准，该结果考虑与IVa期所纳入患者数量不足、统计样本例数有限等因素相关。

综上所述，HIF-1α的表达与宫颈癌放化疗短期、长期疗效之间存在关联性，HIF-1α表达（-）的患者接受放化疗治疗后，短期有效率、2年控局率、2年生存率均较HIF-1α表达（+）患者高，因此HIF-1α可考虑作为不可手术宫颈癌患者治疗效果预测的生物标志物之一。

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