肝内胆管癌中Wip1和MMP-2表达关系及临床意义

张 良 周进学 肖 腾 向宏市

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是起源于二级胆管及其分支上皮的恶性肿瘤[1]。ICC肿瘤无包膜、边缘不清，生物学行为特殊，可沿胆管壁周围或者纵行浸润性生长，侵袭及转移能力极强[2]。近年来，我国ICC发病率呈明显上升趋势，严重危害了我国居民的身体健康及生命安全[3]。根治手术是目前治疗ICC的一线治疗方案，但大多数患者确诊时已为晚期，不适合进行手术治疗[4]。本研究旨在探讨ICC中野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wild type p53 induced protein phosphatases，Wip1)[5]、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表达水平及临床意义，试图为临床治疗ICC提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2015年7月至2016年7月郑州颐和医院及河南省肿瘤医院收治的38例ICC患者肝内胆管癌组织标本为研究对象。所有患者临床资料齐全，且术前均未接受任何放化疗及激素治疗，未合并其他恶性肿瘤，其中男性21例，女性17例；患者年龄28～77岁，平均年龄(54.28±6.43)岁；高分化7例，中分化18例，低分化13例；伴淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者19例；肝炎病毒携带者10例(乙肝9例，丙肝1例)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期24例。

同期选取36例与我院行手术切除术的胆管结石及胆道损伤者正常胆管组织标本为对照，其中胆管结石27例，胆道损伤者9例，患者年龄25～69岁，平均年龄(55.26±5.54)岁。2组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究经本院伦理委员会批准进行，且患者及家属了解本研究，并同意签署知情同意书。

1.2 主要试剂

免疫组织化学(Streptavidin-perosidase，S-P)试剂盒、DAB显色试剂盒，购自于北京中杉金桥技术公司；鼠抗人Wip1单克隆抗体，鼠抗人MMP-2单克隆抗体，购自于武汉博士德生物有限公司。

1.3 方法

胆管组织标本离体后立即放入液氮罐中速冻，于-80 ℃冰箱妥善保存备用。所取标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制作厚度为4 μm的石蜡切片；采用S-P方法，DAB显色，利用S-P试剂盒检测石蜡切片中Wip1、MMP-2蛋白表达，以已知阳性切片为阳性对照，PBS液代替一抗为阴性对照，按照试剂盒使用说明书严格进行。

1.4 结果判定

Wip1、MMP-2均为细胞质、细胞膜表达，以胞质/胞膜染色呈现棕黄色者为阳性表达。400×高倍镜下观察，染色强度评分：无色0分、浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分，阳性细胞数所占比例：0为0分、0～25%为1分、>25%～75%为2分、>75%为3分。以细胞染色强度与阳性细胞所占百分比评分乘积进行统计分析。

1.5 统计学分析

利用统计学软件SPSS 19.1进行数据统计分析，计数资料采用卡方检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组之间Wip1、MMP-2蛋白表达水平比较

ICC组织中Wip1蛋白阳性表达率为78.95%(30/38)，明显高于正常胆管组织中Wip1蛋白阳性表达率8.33%(3/36)，差异有统计学意义(χ2=37.308，P<0.05)，ICC组织中MMP-2蛋白阳性表达率为73.68%(28/38)，明显高于正常胆管组织中MMP-2蛋白阳性表达率5.56%(2/36)(χ2=35.596，P<0.05)。

2.2 Wip1、MMP-2蛋白表达与ICC临床病理特征之间的关系

Wip1蛋白表达与ICC患者年龄、性别、临床分期、有无肝炎、组织学分级无明显相关性(P>0.05)，与患者门静脉浸润、淋巴结转移密切相关(P<0.05)；MMP-2蛋白与ICC患者年龄、性别、有无肝炎、组织学分级无明显相关性(P>0.05)，与患者临床分期、门静脉浸润、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。见表1。

表1 Wip1、MMP-2蛋白表达与ICC临床病理特征之间的关系/例

2.3 ICC组织中Wip1、MMP-2蛋白表达相关性分析

采用卡方检验与Spearman法进行相关性分析，Wip1与MMP-2在ICC组织中表达呈较强正相关(γs=0.683，P<0.05)。

3 讨论

ICC是临床上发病率仅次于肝癌的一种肝脏原发性恶性肿瘤，近年来发病率有明显上升趋势[6]。ICC解剖定位于肝内，早期即可出现周边卫星灶或者淋巴结转移，侵袭及转移能力极强。肝叶切除是目前唯一可能治愈ICC的方法[7]，但因ICC病情进展较快，临床常无法有效把握ICC患者手术时机，预后效果较肝癌更差。探究ICC发病机制，寻找新的特异性肿瘤标记物，或许可为ICC早期诊断及治疗提供新思路。

Wip1基因是由PPM1D基因编码，属丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2C家族中成员之一[8]，位于人类染色体17q23或q24区域。国外学者在野生型小鼠胚胎成纤维细胞转化过程中发现，Wip1基因与原癌基因Myc、Ras及Neul等具有明显协同作用，Wip1基因被证实是一种新型的原癌基因[9]。随后大量研究证实[10]，Wip1基因在卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中明显高表达，且其高表达与肿瘤患者预后存在密切关系。现已发现Wip1基因可直接或者间接作用于包括p53、ATM、p38MAPK、chk1、chk2、UNG2、MDm2在内至少7种靶蛋白去磷酸化，从而降低p53转录活性来发挥致癌作用。目前，国内有关Wip1基因在恶性肿瘤中表达研究相对较少。MMPs是机体一种重要的蛋白水解酶[11]，广泛参与机体胚胎形成、创伤愈合、血管反应等生理反应，以及关节炎、动脉粥样硬化、病毒感染、癌症转移等病理过程。研究表明[12]，MMPs不仅具有有效的清除细胞外基质的作用，还能够通过参与血管生长因子的形成，起到促进肿瘤血管新生，协助肿瘤细胞发生免疫逃逸，广泛参与机体内肿瘤侵袭及转移过程。MMP-2是MMPs家族重要成员之一，其能够有效分解基膜主要成分，MMP-2在恶性肿瘤中过度表达可导致癌细胞发生侵袭及转移能力的增强。研究表明[13-15]，MMP-2在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、胶质瘤等多种肿瘤中呈明显高表达，参与肿瘤发生及发展。因此，本研究以Wip1、MMP-2为研究靶点，探讨二者在ICC组织中表达水平及其与ICC临床病理特征之间的关系，试图为早期诊断及治疗ICC提供新的靶点。

本研究结果表明，ICC组织中Wip1蛋白阳性表达率为78.95%，明显高于正常胆管组织中Wip1蛋白阳性表达率8.33%；ICC组织中MMP-2蛋白阳性表达率为73.68%，明显高于正常胆管组织中MMP-2蛋白阳性表达率5.56%；可见正常组织中Wip1、MMP-2阳性表达均较低，Wip1、MMP-2在ICC组织中明显上调表达，提示Wip1、MMP-2上调表达参与ICC疾病发生。进一步探究二者与ICC临床病理特征之间的关系可见，Wip1、MMP-2蛋白表达与ICC患者年龄、性别、有无肝炎、组织学分级无明显相关性，与患者门静脉浸润、淋巴结转移密切相关，有门静脉浸润及淋巴结转移者Wip1、MMP-2蛋白阳性表达率明显高于无门静脉浸润及淋巴结转移者，其中MMP-2蛋白表达还与患者临床分期关系密切，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2蛋白阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期者，提示二者与ICC疾病发生及发展密切相关，二者高表达与ICC侵袭及转移显著相关，推测Wip1、MMP-2可作为临床早期诊断及治疗ICC的潜在生物学靶点，对于临床诊治ICC具有一定指导意义。相关性分析结果可见，Wip1与MMP-2在ICC组织中表达呈较强正相关，说明Wip1与MMP-2在ICC中异常表达具有协同作用，二者协同促进ICC肿瘤的侵袭及转移，其具体作用机制，值得进一步深入探究。

综上所述，本研究结果表明，Wip1、MMP-2在ICC中明显高表达，二者参与肝内胆管癌发生及发展过程，二者与ICC门静脉浸润、淋巴结转移密切相关。本文首次提出Wip1与MMP-2在ICC中异常表达存在协同作用，后续将对其具体作用机制进行进一步的探讨。