基于电子鼻的花椒油氧化判别分析

向琴，高柳，车振明，刘平，林俊帆，李之友

(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)

花椒油(pepper oil)是从花椒中提取呈香、呈味物质于食用植物油中混合均匀的产品，与食用油类似，易受氧、水、光、热、微生物等的影响而发生水解或氧化酸败，产生异臭和异味，严重的甚至形成有毒物对人体造成危害[1]。目前，通常采用感官评价和理化检测(如酸值、过氧化值测定)来辨别花椒油的氧化变质。感官评价法直观、易实施、无需成本，但主观性较强、误差较大、重复性也较差[2]；理化检测法准确度较高、成本也较低，但耗时较长、需专业检测人员。故而，找到一种简便、准确度高、省时省力的检测方法迫在眉睫，同时有助于促进花椒油市场的规范化。而电子鼻是一种快速有效的检测方式，具有客观性强、测定速度快、操作简单、重现性良好、样品无需复杂前处理等优点。利用电子鼻既能分析痕量气味物质，对样品间气味相似度进行简单比较；也能通过预先采集标准样品建立相应数据库，进而对未知样品进行预测和评判，尤其对气味成分复杂或存在气味协同作用的样品具有良好的监测作用。目前，电子鼻技术已经广泛应用于传统医药、食品和农产品，尤其在质量评价[3-4]、霉变研究[5]、产地及种类鉴别[6-8]、真伪鉴别[9-10]、等级鉴定[11-12]、食品过程监控[13-14]、不同处理时间或条件下的成熟过程[15-17 ]或贮藏效果[18-23]等方面研究较多。

本研究以市场上较常见的10种花椒油为研究对象，采用电子鼻技术测定花椒油的气味变化，同时结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、线性判别分析(LDA)和判别因子分析(DFA)对不同氧化程度的花椒油进行定性判别分析，并建立花椒油氧化的快速判别模型，同时检测判别结果与理化指标进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

川老汇花椒油，四川高福记食品有限公司；幺麻子藤椒油，四川洪雅县幺麻子食品有限公司；五丰黎红花椒油，四川五丰黎红食品有限公司；建华花椒油，四川成都建华食品有限公司；牛市破花椒油，四川省汉源大自然有限公司；九斗碗特麻花椒油，成都宝阳味业有限责任公司；陈麻婆藤椒油，成都陈麻婆川菜调味品有限公司；金龙鱼花椒油，嘉里粮油四川有限公司；长康花椒油，湖南省长康实业有限责任公司；涛胖花椒油，洪雅县兴江食品专业合作社。以上油样基本涵盖四川地区常见的花椒油种类，且生产日期均控制在距离实验日期10 d范围内，保证了油脂的新鲜程度。

三氯甲烷、冰乙酸、KI、Na2SO3、可溶性淀粉、异丙醇、乙醚、百里香酚酞与NaOH(均为分析纯),成都科龙试剂化工厂。

1.2 仪器与设备

PEN3电子鼻，德国Airsense公司，传感器阵列是由10个不同的金属氧化物传感器组成[24-25]，见表1，不同传感器响应不同气味物质。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取10种花椒油油样，置于105 ℃烘箱中进行快速氧化1.5 h[26]，并采用国标法对处理后的样品进行酸值和过氧化值的测定，根据测定结果将样品明确地分为已氧化和未氧化2个阶段，共得到50个不同氧化程度的的样品。

1.3.2 氧化程度指标测定

为确定花椒油样品的氧化程度，采用GB5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[27]和GB5009.229—2016《食品中酸价的测定》[28]对花椒油样品的过氧化值和酸值进行测定。根据GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》[29]的规定，花椒油氧化标准如下：未氧化油的过氧化值≤0.25 g/100 g且酸值≤3 mg/g；氧化油的过氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g。

1.3.3 气体采集及测定条件

1.3.3.1 分析条件的选择

对比分析不同水浴温度和水浴平衡时间对传感器响应强度的影响，选取新鲜川老汇花椒油样品(样品1)为实验对象，准确量取3 mL置于50 mL样品瓶中，立即盖上瓶盖，水浴平衡一段时间后进行电子鼻分析，平衡温度梯度25、35、45、55 ℃，平衡时间梯度2、4、6、8 min，每个梯度平行测定5次。

1.3.3.2 气体采集

准确量取样品3 mL于50 mL样品瓶中，根据1.3.3.1中优化的分析条件，采用顶空吸气法，直接将进样针头插入样品瓶，完成一次检测后待系统进行清零和标准化，然后再进行第2次顶空采样，每个样品平行测定5次。

1.3.3.3 电子鼻检测条件

样品准备时间5 s，检测时间200 s，测量计数1 s，自动调零时间5 s，清洗时间100 s，内部流量400 mL/min，进样流量8 mL/min。

1.3.4 数据分析

对传感器采集的原始数据进行统计学分析，采用Alpha-so 软件和SPSS 20.0提供的CA、PCA、LDA、ANOVA等多种方法进行数据处理，建立花椒油氧化与否的快速判别模型，并利用DFA法对未知样品进行快速判别。

2 结果与分析

2.1 样品氧化程度分布结果分析

根据1.3.2中国标对100组模型集样品以及40组验证集样品的过氧化值和酸值进行测定，氧化程度如表2所示。

表2 样品氧化程度分布Table 2 Distribution of oxidation degree in sample

根据GB 2716—2005的规定，当过氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g时则判定样品发生氧化。由表2可知，当样品过氧化值处于0.25～0.35 g/100g时，其酸值<3.00 mg/g，即以过氧化值为判定依据则样品处于氧化状态，而以酸值为判定依据则样品仍处于非氧化状态。由此可知，采用过氧化值这个指标来判定花椒油氧化较为严格，因此，本实验以过氧化值为主、酸值为辅来判定样品的氧化程度。

2.2 气体采集条件分析

根据1.3.3.1测定结果，得到不同水浴温度、不同水浴平衡时间的电子鼻传感器响应如图1、图2所示。

石爱华等[30]对花椒油中的化学成分进行GC-MS分析，结果表明,花椒油中的挥发性成分多为烯烃、醇类等分子质量较小的化合物，还包括少量的酯类、醇类、酮类化合物，它们在常温下易挥发，如α-水芹烯、2-蒎烯、桧烯、β-月桂烯、大根香叶烯、α-柠檬烯、萜品油烯、别罗勒烯、β-榄香烯、芳樟醇、4-萜烯醇、乙酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、 4-甲基-2-戊酮等。

图1 不同温度下电子鼻的传感器响应(样品1)Fig.1 Sensor responses of E-nose at different temperatures (sample 1)

图2 不同平衡时间下电子鼻的传感器响应(样品1)Fig.2 Sensor responses of E-nose under different equilibrium time(sample 1)

由图1可知，随着样品平衡温度的上升，R1、R3、R4、R5、R8和R10传感器响应强度几乎相等，R2、R6、R7和R9传感器响应强度缓慢上升，且45 ℃下的传感器响应强度和55 ℃下得传感器强度几乎相等，这与石爱华的研究结论相符，但45 ℃下的传感器响应强度的误差远小于55 ℃，说明45 ℃条件下样品顶空气体的稳定性更好，实验的重现性更好，平行组样品强度响应值差异也较小，故本实验选择水浴平衡温度为45 ℃。

由图2可知，随着水浴平衡时间的增长，各传感器响应强度的差异并不明显，基本接近，故主要考虑测定的稳定性，当平衡时间为4 min时，传感器响应强度的误差最小，故本实验选择水浴平衡时间为4 min。

2.3 样品传感器信号分析

随机抽取川老汇的氧化油样与未氧化油样进行电子鼻特征分析，得到相应的传感器信号响应强度如图3、图4所示。

图3 未氧化花椒油传感器响应强度Fig.3 Sensor responses intensity of non-oxidized pepper oil

图4 氧化花椒油传感器响应强度Fig.4 Sensor responses intensity of oxidized pepper oil

图3、图4中每条曲线代表各传感器对该样品挥发性成分的相对电导率随时间的变化情况，相对电导率值越偏离1(大于或者小于1)，表明响应气体质量浓度越大；如果质量浓度低于检测限或未感应到气体，相对电导率则接近于1[26]。由图3和图4可知，进样后，挥发性成分被传感器吸附，相对电导率随之发生改变，电子鼻10 个传感器的响应值先逐渐上升，然后趋于平稳，并在140 s后基本达到稳定状态，因此实验选取141～145 s内的平均响应值作为特征值分析。

不同传感器对油样的响应强度不同，R2、R6、R7和R10传感器的响应较大，其余传感器响应较小，说明花椒油中的主要挥发性成分为氮氧化合物、烷烃类以及含硫化合物。对比氧化油样与未氧化油样的响应信号，发现两者之间存在显著差异：R7传感器对2种油样的响应强度均较高，且未氧化花椒油的响应值更高；在R2传感器上氧化油样的响应强度明显高于未氧化油样，而在R10传感器上的强度明显低于未氧化油样，由此说明氧化油样与未氧化油样的挥发性成分存在显著差异，可以利用电子鼻进行区分。

2.4 CA分析

在解决实际问题过程中，对多个样本进行分类时，依据单因素分类往往不够全面、综合的描述其类别，因此需考虑多方面因素进行分类。CA分析是一种对研究对象或指标的诸多特性进行分类的方法，它将样品按照某种特性的相似程度逐渐聚合在一起，相似度最大的优先聚合在一起，最终按照类别的综合性质多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程[31]。

本研究选取10个传感器141～145 s内响应强度的平均值为特征值进行分析，将所有数据点输入SPSS 20.0，采用离差平方和法(Ward法)进行系统聚类分析，并以平方欧氏距离为度量标准[26]对模型集中100个实验油样进行CA分析，得到树状图如图5所示。

图5 氧化与未氧化花椒油挥发性物质聚类分析(CA)Fig.5 Clustering analysis of volatile compounds in oxidized and non-oxidized pepper oils

最小距离水平上，所有样品总共形成了5个小类，每一小类所包含的样品之间具有极大的相似性。随着欧式距离的增大，第2小类和第3小类继续聚为一类，第4小类和第5小类继续聚为一类。当欧氏距离增至5时，第1小类才聚入第2小类、第3小类，说明第1小类所包含的样品与第2小类、第3小类所包含的样品在挥发性风味特性上具有一定的相似性，而与第4小类和第5小类所包含样品相似性较差。由图5可明显看出，100个模型集样品明显聚为两类，对比样品国标法所测得的过氧化值和酸值，聚类结果与国标法测定结果相一致。由此可知，利用电子鼻结合CA分析法可以对花椒油氧化进行判别。

2.5 PCA分析

PCA分析是降低数据维度和解决多重共线性问题最常用的多变量统计方法之一。该方法简化了获取样品信息的任务，采用非监督式的投影方法，通过对原始变量的不相关和线性组合形成新变量来整合数据。通常，这些新变量(称为主要组件(PC))能够解释整个数据中绝大多数变量，即仅考虑几个新变量就能将高维数据以最小的信息损失降低到更低的维度[32]。因此，该法常用于获取复杂样品的数据信息和对高维度数据信息进行降维。

为了更有效地区分氧化油样和未氧化油样，本研究采用降维的PCA分析法对样品进一步分析以期望达到更好的分离效果。根据电子鼻响应信号，对10个传感器的响应值进行主成分分析，结果如图6所示。

图6 氧化花椒油与非氧化花椒油样的主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由图6可知，PC1的方差贡献率为92.65%，PC2的方差贡献率为6.91%，PC1和PC2的总贡献率达99.561%>85%，说明前2个主成分足以代表油样的整体信息，PCA分析结果有效。所有样品被分成两簇，且两簇之间明显区分开，说明氧化油样与未氧化油样的风味差异较大，能够被电子鼻区分，区分结果与国标测定的结果相一致。因此，利用电子鼻结合PCA分析法可以辨别花椒油氧化与否。

2.6 LDA分析

LDA能够将n维数据投影到低维空间，使投影后组与组之间尽可能分开，以最大的组间距离和最小的组内距离为衡量标准来判断样品的可分离性[33]。将模型集样品传感器在141～145 s的响应平均值作为特征值，通过LDA分析法进行分析，如图7所示。

图7 氧化花椒油与未氧化花椒油的线性判别分析(LDA)Fig.7 Linear discriminant analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由图7可知，LD1方差贡献率为47.72%，LD2方差贡献率为6.61%，总贡献率达到54.33%。总贡献率相对较小，但2种油样的组间差异明显增大，组内差异明显减小。通过对验证集样品的判别，所有油样均能成功，因此，LDA分析法也可以作为花椒油氧化与否的判别方式之一。

2.7 DFA分析

DFA分析是一种基于数据演绎的分类方法。与PCA分析不同，它是一种监督式的分类方法，通过估算不同类别之间的边界值，使得类别之间的方差最大化，并且各类中的方差最小化。因此，线性组合最大化了这些维度的贡献，进而使得预测组之间产生最大化的差异，使用该方法可以根据不同的属性对同一数据集进行不同的分类[32]。

2.7.1 全变量DFA模型分析

将模型集样品的所有传感器响应值数据进行DFA分析，并建立相应的DFA模型，并对40组验证集样品进行随机编号U1～U40，利用DFA模型进行验证，若分组结果与国标测定一致，则显示为yes，否则显示为no，判别率结果见表3。

表3 验证集油样的判别结果Table 3 Identification results of the validation set in pepper oil samples

由表3可知，利用模型集样品的传感器响应值进行DFA建模，所建模型对40组未知样品的识别效果较差，且对未知样品U2、U8、U15、U19、U24、U30、U33、U37和U40识别错误，结合该9种油样的过氧化值，分别为0.254、0.249、0.251、0.245、0.223、0.255、0.248、0.252、0.246 g/100 g，由此可知利用所有传感器响应数据所建DFA模型对氧化临界值附近的样品判别效果较差，因此，有必要对10个传感器进行优化。

2.7.2 传感器优化DFA分析

方差分析(ANOVA分析)，又称“变异数分析”或“F检验”，是用于2个及2个以上样本均数差别的显著性检验，方差分析的目标为经过数据分析判断敏感因素、因素间的相互影响以及敏感因素的最佳值等[34]，其结果常以F值和p值的大小来表示。与给定显著水平的标准F值相比较，若F值越大，说明处理之间效果或差异越明显；若F值越小，说明试验精度越高。

以模型集20组样品(每组样品5次平行)的传感器响应值为研究对象，利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(ANOVA)来优选传感器，结果见表4。最终选择F值>120的传感器为DFA建模的最优传感器，即以W5S、W1W、W2W和W3S等4根传感器为优选传感器。

表4 传感器响应方差分析结果Table 4 Variance analysis results of the sensor respondsin pepper oil samples

利用以上述优选传感器重新对模型集样品进行DFA分析，并以2.7.1中识别错误的9个样品以及随机抽取的1个样品作为验证集，依次编号XU1～XU10，并对新建模型进行验证，结果见表5。

表5 10个未知样品的判别结果Table 5 Identification results of 10 unknown pepper oilsamples

由表5可知，采用优选传感器建立的DFA模型，10个未知样本均落在相应的组别，判别效果良好，判别正确率均大于96%。因此，利用电子鼻的优选传感器结合DFA法能够有效判别花椒油样品氧化与否，且可行性较高。

2.8 模型验证结果

为了进一步验证本实验所建花椒油氧化快速模型的可靠性，利用CA、PCA、LDA和DFA所建模型对未参与建模的40个验证样品进行判别分析，并计算判别正确率：判别正确率=判断正确个数÷总的判断次数，其结果见表6。

表6 盲样的CA、PCA、LDA和DFA的验证结果Table 6 Validation results of CA，PCA，LDA and DFA inunknown pepper oil samples

由表6可知，当40组验证样品经CA时，有1个未氧化和1个已氧化错误，与国标方法判定结果不一致，对应的过氧化值分别为0.230、0.270 g/100 g，均在临界值附近，与标准相差较小；经PCA时，仅有1个未氧化样品错误，其过氧化值为0.24 g/100 g，处于未氧化状态，造成错误的原因在于接近氧化临界值(0.25 g/100 g)较接近，使得模型误判；经LDA时，所有验证集样品均正确，与国标判定结果一致；经DFA时，有2个未氧化油样和1个已氧化油样错误，与国标判定结果不一致。

综上所述，电子鼻技术结合CA、PCA、LDA和DFA分析法基本能有效花椒油氧化与否，且LDA法的效果最稳定，能够有效地避免主观因素对结果的影响，同时克服了传统理化方法的缺点，达到了快速检测的目的。

3 结论

利用电子鼻技术对花椒油的气味成分进行了分析，确定了花椒油中的挥发性物质主要为氮氧化合物、烷烃类以及含硫化合物等。结合CA、PCA、LDA、DFA等分析方法建立了花椒油氧化的快速模型，并对模型进行了验证，判别正确率分别为95.0%、97.25%、100%，97.50%。因此，CA、PCA、LDA、DFA分析法均能有效花椒油氧化与否，且LDA法效果较好。