凝结芽孢杆菌复合干酪乳杆菌发酵南瓜饮料的研制

马欣,古绍彬,2,3*,吴影,2

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳，471023)2(食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳，471023) 3(洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，河南 洛阳，471023)

南瓜(Cucurbitamoschata)是葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属，1年生双子叶蔓性草本植物，又称倭瓜、金冬瓜等。南瓜营养成分丰富且全面，在三大产热营养素中，以碳水化合物为主，且脂肪含量较低[1]。此外还含果胶、纤维素、淀粉、蛋白质、β-胡萝卜素、矿物质、戊聚糖、甘露醇、腺嘌呤、南瓜多糖及多种氨基酸等成分[2-5]。

据联合国粮食及农业组织FAOSTAT数据显示，2014年我国肉用南瓜生产面积80万公顷左右，总产量超过2 900万t，居世界第一，然而利用率却极低，产业链不长，这不仅严重制约了我国南瓜产业的发展，还导致了资源的极大浪费[6]。目前，果蔬型发酵饮料由于综合了果蔬汁和乳酸发酵的优点，在欧美、日本等发达国家广受欢迎，得到广泛研究与开发[7]。因此，以南瓜为原料，以我国卫计委新批准的人用益生凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)和健康三益菌之一的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)为发酵剂，研制发酵型南瓜饮料，不仅能为南瓜资源的综合利用提供有力支撑，还可丰富国内活菌饮料产品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜜本南瓜，采购于当地农贸市场；凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC102为本实验室保藏菌种。

β-胡萝卜素标准品，北京索莱宝科技有限公司；生理体液氨基酸、蛋白水解氨基酸标准品，德国Membra Pure公司；所有分离用有机试剂均为国产分析纯；纤维素酶，酶活单位50 000 U/g，果胶酶，酶活单位20 000 U/g，葡萄糖淀粉酶，酶活单位100 000 U/g 3种酶均购于上海蓝季科技发展有限公司。

1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；A300型全自动氨基酸分析仪，德国Membra Pure公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及种子制备

将凝结芽孢杆菌接种于改良LB培养基中，37 ℃，230 r/min恒温振荡培养18 h；将干酪乳杆菌接种于MRS培养基中，37 ℃静置培养18 h。

1.2.2 发酵型南瓜饮料制备工艺流程及操作要点

选用肉质橘黄、无病虫腐蚀的成熟南瓜为原料，清净后除去表皮及种籽，将瓜肉处理为0.5 cm厚度的瓜片，并置于沸水中热烫5 min，使组织充分软化。软化后按料水比1∶2(g∶mL)加水打浆，添加1.8%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.25%葡萄糖淀粉酶于南瓜汁中，50 ℃水浴酶解3 h[8]。酶解完成后于100 ℃灭菌10 min[9]，冷却至室温然后接种发酵，发酵结束后于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.3 南瓜汁中凝结芽孢杆菌发酵特性研究

将凝结芽孢杆菌以3%(活菌数约为1×107CFU/mL)的接种量添加到经前处理的南瓜汁中，于37 ℃，230 r/min培养24 h，每隔2 h取样监测发酵南瓜汁中菌落总数、pH、可滴定酸及还原糖等的变化。

1.2.4 凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌偶联发酵工艺

以上述凝结芽孢杆菌单菌发酵特性研究为基础，以干酪乳杆菌接种量、偶联发酵时间、偶联发酵温度为影响因素，考察各因素对菌落总数的影响，确定各个影响因素的范围，以发酵南瓜饮料的活菌总数为响应值，通过Box-Behnken试验设计对偶联发酵工艺进行优化。

1.3 发酵过程参数的测定

凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌活菌总数测定：平板稀释活菌计数法。活菌总数：凝结芽孢杆菌与干酪乳杆菌活菌总数之和；pH测定：采用PH400基础型台式pH计；可滴定酸度测定：用已标定的0.1 mol/L/NaOH标准溶液进行酸碱滴定；还原糖测定：采用DNS法测定还原糖含量[10]；南瓜粗多糖：热水浸提法[11]；多酚含量：福林酚试剂法[12]；Vc含量：2，6-二氯酚靛酚滴定法[13]。

β-胡萝卜素：高效液相色谱法[14]。色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18250 mm×4 mm,5 μm。流动相A: 甲醇，流动相 B：乙酸乙酯。洗脱顺序：0～20 min，90%～85%A;20～30 min，85%～70%A。柱温：25 ℃，检测波长：450 nm，流速：1.2 mL/min，进样量：10 μL。

氨基酸含量测定：高效阳离子交换色谱(HPCEC)-柱后茚三酮衍生化法[15]，锂盐体系同时测定游离氨基酸与水解氨基酸，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 复合酶添加对南瓜汁出汁率和还原糖含量的影响

南瓜中碳水化合物占南瓜干物质量的60%左右，果胶约占10%～15%，纤维素约占10%。为提高南瓜的出汁率和南瓜汁的可发酵性，本研究在单一酶添加量的基础上，即1.8%纤维素酶，0.3%果胶酶，0.25%葡萄糖淀粉酶，采用两两组合和三三组合进行复合酶解试验。结果如图1所示，复合酶处理可以显著提高南瓜出汁率和还原糖含量，其中三酶复合酶解时，还原糖含量和出汁率分别达到22.78 g/L和85.45%，较未酶解南瓜汁的还原糖含量和出汁率有显著提高。

1-未酶解南瓜汁；2-纤维素酶；3-果胶酶；4-糖化酶；5-果胶酶+纤维素酶；6-果胶酶+糖化酶；7-纤维素酶+糖化酶；8-纤维素酶+糖化酶+果胶酶图1 复合酶对还原糖含量及出汁率的影响Fig.1 Effect of complex enzymes on reducing sugar content and juice yield

2.2 复合益生菌发酵南瓜饮料工艺研究

2.2.1 凝结芽孢杆菌发酵特性研究

将活化后的凝结芽孢杆菌接种于经酶解灭菌后的南瓜汁中。如图2所示，在前4 h菌体处于适应期，生长缓慢，还原糖消耗较低，随着进入对数生长期，菌体密度迅速增长，培养基中还原糖含量持续下降，当培养到16 h时，菌体密度接近最大值，达到6.5×108CFU/mL。此后，尽管培养基中还含较多的还原糖，但2 h后活菌数仍开始缓慢下降，这可能是由于随着发酵时间延长，菌体利用南瓜汁中糖代谢产生了包括L-乳酸在内的大量有机酸[16]，从而导致了发酵醪中pH急剧下降，在10 h时pH值已降为4.27，可滴定酸达到了0.54%(见图3)。

图2 凝结芽孢杆菌发酵过程中活菌数及还原糖的变化Fig.2 Changes of viable count and reducing sugar in fermentation of Bacillus coagulans

图3 凝结芽孢杆菌发酵过程中pH及可滴定酸的变化Fig.3 Changes of pH and titratable acid during fermentation of Bacillus coagulans

2.2.2 干酪乳杆菌发酵特性研究

将活化后的干酪杆菌接种于经酶解灭菌后的南瓜汁中，可观察到类似于凝结芽孢杆菌的曲线(见图4)，至发酵后期，pH降至3.3左右，可滴定酸含量达到1.2%(见图5)，说明其产酸能力明显强于凝结芽孢杆菌CGMCC 9951。因此为保证发酵型南瓜饮料中有足够的凝结芽孢杆菌的活菌数，拟采用两菌偶联发酵工艺，即先接种凝结芽孢杆菌，待前者生长到对数生长后期后，再接种干酪乳杆菌。为此，本文进行了干酪乳杆菌接种量、偶联发酵时间、偶联发酵温度等对活菌总数影响的相关研究。

图4 干酪乳杆菌发酵过程中活菌数及还原糖的变化Fig.4 Changes of viable count and reducing sugar in Fermentation of Lactobacillus casei

图5 干酪乳杆菌发酵过程中pH及可滴定酸的变化Fig.5 Changes of pH and titratable acid in Fermentation of Lactobacillus casei

2.2.3 偶联发酵单因素试验

2.2.3.1 干酪乳杆菌接种量对活菌总数的影响

接种量对菌体的生长繁殖影响显著，尤其在耦合发酵工艺中，后续接种的微生物，其接种量更是影响发酵能否成功的关键。研究结果如图6所示，活菌总数随着接种量的增加，呈现先增加后减小的趋势。当接种量大于3%时，活菌总数明显下降，这主要由于接种量增加，导致了干酪乳杆菌早期快速生长繁殖，引起发酵液中产酸量急剧增加，一方面导致菌体生长代谢被抑制，另一方面也诱发部分菌体出现自溶和衰退现象[17]。因此干酪乳杆菌最适接种量为3%(V/V)，此时活菌总数为2.23×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌活菌数为1.67×109CFU/mL。

图6 不同接种量对活菌总数的影响Fig.6 Effects of different inoculation amount on total viable count注：偶联发酵时间为6 h，偶联发酵温度为37 ℃

2.2.3.2 偶联发酵时间对活菌总数的影响

由于干酪乳杆菌LC102产酸能力较凝结芽孢杆菌CGMCC 9951强，且后者的酸耐受能力弱于前者，因此凝结芽孢杆菌生长到对数生长期后再开始接入干酪乳杆菌后，共培养时间长短成为决定耦合工艺是否成功的又一关键因素，结果如图7所示。随着发酵时间的延长，活菌总数呈先增大后降低的趋势，偶联发酵8 h达到最大值3.37×109CFU/mL，此时凝结芽孢杆菌活菌数为1.95×109CFU/mL。

图7 不同发酵时间对活菌总数的影响Fig.7 Effects of different fermentation time on the total viable count注：干酪乳杆菌接种量为3%，偶联发酵温度为37 ℃

2.2.3.3 偶联发酵温度对活菌总数的影响

对于偶联发酵而言，偶联培养温度对发酵十分关键，温度过高或过低都会影响发酵菌株生长及代谢情况。研究结果如图8所示，当温度为22～37 ℃时，菌体的生长繁殖随温度的上升增加，随着温度继续增加时，活菌总数开始降低，当温度维持在37 ℃时活菌总数和凝结芽孢杆菌总数分别达到3.33×109和1.97×109CFU/mL。

图8 不同发酵温度对活菌总数的影响Fig.8 Effect of fermentation temperature on the total number of viable count注：干酪乳杆菌接种量为3%，偶联发酵时间为8 h

2.2.4 响应面优化试验结果与分析

2.2.4.1 响应面试验方案及结果

根据Bo-Benhnken试验设计，在单因素试验设计的基础上，选择干酪乳杆菌接种量(A)、偶联发酵时间(B)、偶联发酵温度(C)为自变量，以活菌总数为响应值，采用响应面分析法对发酵工艺条件进行优化。试验因素水平表见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels of response surface analysis

根据表1的试验因素与水平设计，进行三因素三水平的响应面试验，具体方案及结果见表2。

利用Design Expert软件对表2试验结果进行二次多项式拟合，根据各项的回归系数，获得的二次回归模型方程为：

X=3.13+0.089A+0.025B+0.091C-0.098AB-0.25AC-0.073BC-0.70A2-0.52B2-0.41C2。

其中：X,活菌总数,109CFU/mL；A,干酪乳杆菌接种量,%；B,发酵时间,h；C,发酵温度,℃。

表2 响应面分析试验结果Table 2 Results of respose surface analysis

2.2.4.2 响应面模型的分析

如表3的方差分析所示，该回归模型F值为89.11，prob>F值小于0.000 1，从而可以表明该模型达到极显著的水平，同时，该模型失拟项不显著p>0.1，决定系数R2=0.991 3，表明数据与模型拟合良好、模型可用。回归模型系数的显著性分析结果表明，AC、A2、B2、C2对活菌总数影响极显著，A、C、AB对活菌总数影响显著，B、BC对活菌总数影响不显著。对活菌总数影响的主次因素依次为偶联发酵温度>接种量>偶联发酵时间。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注：**代表差异极显著p<0.01；*代表差异显著0.01

2.2.4.3 各因素间的交互作用分析

如图9～图11，为各因素间交互作用对发酵南瓜饮料活菌总数的影响。由图可知，各因素之间的交互作用都随着因素水平的增加，活菌总数呈先增加后降低的趋势。接种量(A)和偶联发酵温度(C)、接种量(A)和偶联发酵时间(B)等高线图趋于椭圆形，说明其交互作用较强，对活菌总数的影响较大。而发酵时间(B)和发酵温度(C)之间的交互对活菌总数影响则相对较小。

图9 接种量与发酵时间交互作用响应面图Fig.9 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation time

图10 接种量与发酵温度交互作用响应面图Fig.10 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation temperature

图11 发酵时间与发酵温度交互作用响应面图Fig.11 The 3D-surface showing the interaction between fermentation time and fermentation temperature

2.2.4.4 发酵最佳工艺的优化与验证试验

利用Design Expert软件进行分析，得到发酵南瓜饮料最佳工艺条件是接种量3.05%(V∶V)、发酵时间8.03 h、发酵温度37.48 ℃，在此条件下活菌总数的预测值为3.135×109CFU/mL。考虑到试验操作的实际情况，将各参数稍作调整，即接种量3%(V∶V)、发酵时间8 h、发酵温度37.5 ℃。为了验证响应面分析最佳条件的准确性和可靠性，按上述最佳工艺条件进行3次重复试验。结果显示，3次重复试验的平均值为(2.98±0.65)×109CFU/mL,与3.135×109CFU/mL接近，说明该模型准确可靠。

对优化后的发酵南瓜饮料的理化指标进行测定，结果见表4。

表4 发酵南瓜饮料的理化指标Table 4 The physicochemical index of fermentedpumpkin beverage

2.3 发酵型南瓜饮料功能成分研究

众所周知，南瓜富含多种营养成分，如氨基酸、多糖、多酚以及活性成分,如β-胡萝卜素，经发酵后的南瓜饮料的上述物质保留情况是决定其品质的又一重要因素。经测定发酵型南瓜饮料中粗多糖含量(见表5)与未经发酵的南瓜中粗多糖的含量较为接近,可达到1.5%。β-胡萝卜素、Vc是重要的抗氧化物质，经发酵后两者均得到较好的保留。

表5 发酵前后南瓜饮料功能成分含量变化Table 5 Changes of functional composition of unfermentationand fermentation pumpkin drink

南瓜中含有人体所需的多种氨基酸。本文研究发酵前后南瓜饮料中游离氨基酸、水解氨基酸的变化情况，由表6、表7可知，发酵南瓜汁中富含18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸和儿童必需的组氨酸，以及谷类食物较易缺乏的赖氨酸。此外，本研究发现发酵南瓜饮料还含有具有降血压、抗惊厥、镇痛和改善记忆等多种药理作用的γ-氨基丁酸。

3 结论

表6 南瓜汁发酵前后水解氨基酸检测结果表 Table 6 The results of hydrolytic amino acids test inunfermentation and fermentation pumpkin drink

表7 南瓜汁发酵前后游离氨基酸检测结果表Table 7 The results of free amino acids test in unfermentationand fermentation pumpkin drink

注：“-”表示不存在此种游离氨基酸。

本研究以南瓜为原料，通过纤维素酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶复合酶解获得可发酵性糖为22.78 g/L的南瓜汁发酵醪液。在单因素试验的基础上，以活菌总数为响应值，采用Box-Benhnken设计优化发酵南瓜饮料工艺条件。以3%(V∶V)的接种量接种凝结芽孢杆菌CGMCC9951，培养16 h后再以相同接种量接种干酪乳杆菌LC102，进行8 h偶联发酵，最终获得活菌总数为3.072×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌为1.89×109CFU/mL的发酵南瓜活菌饮料。通过对其中营养功能成分测定，发酵南瓜饮料功能成分得到较好保留。氨基酸分析仪分析结果表明，发酵南瓜饮料富含18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸以及儿童必需的组氨酸和谷类食物较易缺乏的赖氨酸。本方法研制的发酵南瓜饮料，采用我国新批准的人用益生凝结芽孢杆菌和干酪乳杆菌进行混合发酵，开发出营养丰富的发酵饮品，为南瓜利用提供支撑，同时为凝结芽孢杆菌在食品中的应用提供一定参考。