馒头质构性状与单核苷酸多态性标记关联分析

刘娟，陈广凤，田纪春，吴澎*，赵子彤，杨艺，李向阳，唐晓珍

1(山东农业大学 食品学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安，271018) 2(德州学院 生态与景观学院，山东 德州，253023) 3(山东农业大学，小麦品质育种研究室，山东省作物生物学重点实验室，山东 泰安，271018)

馒头作为我国北方人民的主食，在膳食结构中一直占有重要的地位。馒头的质构性状也一直被作为评价馒头感官质量的好坏重要指标，良好的质构性状不仅会提升馒头的感官质量，同时，也会增加其经济价值。因此，改良馒头的质构性状对馒头的生产和销售具有重要的意义。目前，已有许多有关馒头质构性状的研究[1-7]。但这类研究大多聚焦于小麦粉碎颗粒度、添加膳食纤维或者酵母等影响馒头质构的外部因素，未能深入探究影响馒头质构的内部因素即原料小麦基因位点的多态性。

近几年，利用全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)进行目标性状与遗传基因标记或候选基因的关联研究成为热点。GWAS是通过利用表型性状和基因自身或临近基因较小区域的分子标记的关联来实现基因的精确定位[8-10]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)标记作为新型的第三代分子标记，与传统分子标记相比SNP具有数量多、分布广和密度高的特点，能在待测基因的附近和内部提供一系列标记[11-12]。目前已应用于遗传图谱的构建[13]、分子标记辅助育种[14-16]以及遗传和物种进化分析[17-18]，但基于SNP标记的小麦类产品如馒头、面条等的全基因组关联分析的研究未有报道。

本研究以205份不同品种的冬小麦为实验材料，利用分布于小麦全基因组的24 355个SNP标记进行性状与标记间的关联分析，以实现馒头质构性状的精细基因定位，为从分子角度全面深入研究馒头的各品质性状奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与表型鉴定

实验材料为205份来自于中国10个种植冬小麦的省份及墨西哥与法国的小麦品种，其中203份来自于中国，2份分别来自于墨西哥与法国(表1)。供试材料中有132份品种为骨干亲本，73份为高代品系。

在2014和2015年度，分别将205份不同小麦品种种植于山东德州(德州市农业科学院)与山东泰安(山东农业大学)，种植条件为：每份材料播种3行，行长2 m，行间距0.25 m，每行播种70粒，重复两次。小麦生长期间，进行常规田间管理，没有出现严重的病虫害现象。

表1 供试小麦材料Table 1 Wheat varieties used in this study

小麦成熟后，进行收割，并研磨成面粉，将面粉按照最初来源进行编号后参照周素梅等[19]的实验室馒头制作方法并略做改进。待馒头冷却后，平放于桌面上，用切割机将馒头沿竖直方向平行切割成3片，取中间片于质构仪上，在TPA模式下采用P35探头进行压缩实验[20]，测试前速度3.00 mm/s，测试和测试后速度1.0 mm/s，压缩距离50%。第一次压缩结束后，探头回到起始位置，等待3s后进行第二次压缩。并采用SPSS 18.0软件统计分析所得数据。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根据稍作改动的Triticarte (http://www.triticarte.com.au)方法从不同品种小麦幼叶组织中提取DNA，用0.8%浓度琼脂糖电泳对DNA的浓度和质量进行测定。委托加利弗尼亚大学生物技术检测中心，使用最新开发的包含81 587个SNP位点的小麦90K基因芯片对DNA数据进行分型，并用GenomeStudio软件读取分型结果并保存。为确保分型数据结果的质量，用PLINK v1.07[21]进行检测，选取低基因频率大于5%和检出率大于80%的SNP标记用于馒头色泽性状关联分析[22]，最终得到24 355个SNP位点。

利用WANG等[23]整合的遗传位点信息，对本研究获得的基因位点进行整合，得到实验群体SNP复合遗传图谱信息(表2)。

表2 SNP复合遗传图谱信息Table 2 Information of SNP in the integrated linkage map

1.3 性状和标记的关联分析

分别运用3种模型GLM、GLM_Q、MLM_Q+K对E3环境中的馒头胶着感性状进行关联分析研究，旨在选出适合关联分析的最优统计模型。在此基础上利用TASSEL 3.0 软件对目标性状进行关联分析，当标记的p<0.001时表明该标记与性状有显著关联，p<0.000 1时说明两者存在极显著关联，当标记在两个及以上环境中同时被检测到则认为其是目标性状相对稳定的关联位点。

2 结果与分析

2.1 馒头内外质构表型变异分析

4个环境中馒头质构相关性状的表型数据如表3所示，7个色泽相关性状均表现出较大的变异系数。其中，E1环境黏着性变异系数最大(58.50%)；弹性变异系数最小(3.21%)。除此之外，7个性状的峰度和偏度的绝对值大部分都小于1，符合正态分布，属于数量性状遗传，适合进行关联分析。

表3 四个环境下馒头质构在群体中的表型数据Table 3 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environment

注：E1：2014年泰安点；E2：2014年德州点；E3：2015年泰安点；E4：2015年德州点。

2.2 关联分析最优统计模型的选择

运用3种模型对E3环境中馒头馒头胶著性进行关联分析，得到Manhattan图和Q-Q plot图如图1所示。图1-a为GLM模型，Manhattan图表明该模型获得大量与相关性状显著关联的SNP位点，Q-Q plot图则显示显著位点的P值明显偏离预期P值，群体存在分层的现象，表明GLM模型对群体结构校正作用较差，不能很好的控制关联分析结果的假阳性。图1-b为GLM_Q模型，因该模型控制了群体结构Q，使得与GLM模型相比，Manhattan图检测到的显著关联SNP位点数减少，Q-Q plot图同样表明显著位点的P值明显偏离预期P值。当采用MLM_Q+K模型时，由于其同时对亲缘关系和群体结构进行控制，Manhattan图获得的显著位点明显减少，说明该模型可较大程度的减少假阳性位点，其Q-Q plot图显示的实际P值与预期P值吻合，表明可较好地校正群体结构，因此，MLM_Q+K模型的关联分析结果是准确可靠的，本实验选择MLM_Q+K模型对馒头质构进行全基因关联分析。

a-GLM模型; b-GLM_Q模型; c-MLM_Q+K模型图1 E3环境3种模型馒头胶着感全基因组关联分析的Manhattan图和Q-Q plot 图Fig.1 Manhattan plot and Q-Q plot of GWAS for close feeling using three Modes in two environments注：红色水平线代表全基因组关联分析的显著阈值(p<0.001)。

2.3 SNP标记与馒头质构相关性状的关联分析

通过全基因组关联分析，4个环境共检测到313个与馒头质构性状存在显著关联(p<0.001)的位点，其中，31个极显著(p<0.000 1)关联位点，单个关联位点的遗传变异贡献率为8.93%～25.14%，11个相对稳定关联位点，46个高遗传贡献率位点(R2>10%)，分布在小麦21条染色体中的15条(表4)。

表4 四个环境中与馒头质构相关性状极显著 (p<0.000 1)、高贡献率和稳定位点Table 4 Highly significant (p<0.000 1) , or high genetic contribution and stable association MTAs for texturetraits of steamed bread in four environments

续表4

性状标记染色体位置R2/%p值环境GENE-2794_5345B11011.362.98E-05E3BS00084907_515B14410.267.00E-05E3BS00067911_517A23211.604.19E-05E4wsnp_JD_c13673_136060667B13610.512.69E-05E4BS00023069_517B17110.423.57E-04E2咀嚼性Excalibur_c4948_907B14514.614.12E-05E2Tdurum_contig61884_8367B14813.38,10.414.35E-05,2.52E-05E1,E2IAAV88367B14413.244.75E-05E2BS00041585_512B709.701.03E-05E1黏聚性BS00065168_511A1710.939.99E-04E2Kukri_c13329_8002D3713.80,12.755.99E-06,5.35E-06E1,E4Tdurum_contig5009_3493A18210.364.87E-04E2RFL_Contig3008_13703B910.745.68E-04E3Tdurum_contig45817_1933B1069.649.72E-05E1BS00067744_515B1018.93,7.832.37E-05,4.79E-04E3,E4RAC875_c27696_7187A13611.851.50E-05E2Tdurum_contig56175_7917A1369.357.07E-05E2硬度BS00041585_512B7010.515.82E-05E1IAAV42062B7010.266.28E-05E1RAC875_c12766_4612B7010.266.28E-05E1IAAV22772B7010.176.79E-05E1BobWhite_c8436_3914A1538.62,7.493.21E-04,6.85E-04E1,E4Tdurum_contig61884_8367B14813.494.59E-05E2Excalibur_c4948_907B14513.031.00E-04E2IAAV88367B14411.971.16E-04E2BS00066342_517B1559.43,7.317.65E-05,8.64E-04E2,E3弹性wsnp_Ex_c10595_172919991A7110.426.13E-05E3Ex_c21450_3961A719.869.46E-05E3Ra_c69908_18771A719.829.72E-05E3Ex_c3201_10461A14010.493.39E-04E2wsnp_Ex_c59373_602608762A8310.024.54E-04E2IAAV15352B14513.665.06E-05E2Tdurum_contig10048_612B14610.074.44E-04E2Tdurum_contig52627_7262B14610.074.44E-04E2BobWhite_c12911_7882B14710.074.44E-04E2wsnp_CAP11_c3226_15880702B14710.074.44E-04E2Excalibur_c4964_2755A3910.134.31E-04E2BS00099401_516A14110.473.44E-04E2GENE-4717_7967D19310.034.56E-04E2回复性Kukri_c13329_8002D3713.109.39E-06E1RAC875_c5427_4473B9210.583.58E-04E2RAC875_c27696_7187A1369.32,7.637.11-04,5.87E-04E2,E4胶著性Ex_c5445_9815A166.19,5.494.92E-04,9.49E-04E1,E2BS00000020_515D10315.01,11.782.62E-11,4.44E-10E1,E2

注：E1：2014年泰安点；E2:2014年德州点；E3:2015年泰安点；E4:2015年德州点。

检测到与黏着性极显著(p<0.000 1)相关的位点12个，分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、5B、7A、7B染色体上，单个关联位点的表型变异贡献率为10.12%～25.14%；位于2A染色体上的位点Kukri_c79633_88、3B染色体上的wsnp_Ex_c40060_47197713和5B染色体上的Tdurum_contig23273_315在两个环境中被同时检测到，为相对稳定关联位点；3B染色体上的RFL_Contig5418_347的表型变异贡献率最大(25.14%)，但只在E3环境中被检测到。

检测到4个与咀嚼性极显著关联的位点，分布在2B和7B两条染色体上，单个关联位点的表型变异贡献率为9.70%～14.61%；位于7B染色体上极显著位点Tdurum_contig61884_836在两个环境中表达，且贡献率(R2)大于10%，为主效关联位点。

与黏聚性极显著关联的位点为4个，分布在2B、3D、7A染色体上，单个关联位点的表型变异贡献率为8.93%～13.80%；2D染色体上的位点Kukri_c13329_800与5B染色体上的BS00067744_51在两个环境中同时被检测到，并且极显著关联位点Kukri_c13329_800，贡献率大于10%，为主效关联位点。

与硬度极显著关联的位点为5个，分布在1A、2A、2B、5A、6A、7D染色体上，单个关联位点的表型变异贡献率为10.17%～13.49%；4A染色体上的位点BobWhite_c8436_391与7B染色体上的BS00066342_51在两个环境中表达，为相对稳定位点。

检测到4个与弹性极显著关联的位点，分布在2B和7B两条染色体上，单个关联位点的表型变异贡献率为9.82%～13.66%；3B染色体上的IAAV1535的表型变异贡献率最大(13.66%)，但只在E2环境中被检测到。

检测到与回复性和胶著性极显著关联的位点较少，分别为1个，7A染色体上与回复性相关联的位点RAC875_C27696_718在两个环境中表达，为相对稳定位点，同为相对稳定位点的还有与胶著性关联的5A染色体上的位点Ex_c5445_981和5D染色体上的位点BS00000020_51，后者的贡献率大于10%，为主效关联位点。

2.4 馒头质构多效性关联位点

在与馒头质构性状显著关联的位点中(p<0.001)，同时与2个及2个以上性状存在关联的位点被称为多效性关联位点(表5)。本实验共检测到23个与馒头质构性状存在显著关联的多效性位点，其中染色体2D上位点Kukri_c13329_800与染色体7A上的位点wsnpcEx_c14654_22713386同时关联性状最多(4个)，其次为2B染色体上Tdurum_contig14707_251、4B染色体上Tdurum_contig4974_355和7D染色体上D_contig06359contig118(3个)，1A染色体上BS00056823_51和2A染色体上wsnpcEx_c19556_28530231等18个位点关联性状最少(2个)。

3 讨论

全基因组关联分析(GWAS)是将自然群体作为研究的对象，基于该群体长期的基因重组所导致的连锁不平衡现象，利用分布于全基因组的SNP来实现目标性状的多样性与基因位点的关联分析，从而可检测出与目标性状多样性有密切关联的基因位点或SNP。目前，GWAS已广泛应用于玉米[24]、水稻[25]等农作物的农艺性状相关位点的挖掘中，由于小麦全基因组的精密图谱一直在完善之中，因此整合构建遗传图谱可为GWAS的进行提供精细的SNP遗传位点信息，具有重要的意义。COLASUONNO等[26]利用硬粒小麦的重组自交系构建了包含467个DArT、5 019个SNP、182个SSR标记的遗传连锁图谱，并定位了7个与色黄素含量有关的QTL；RAZ等[27]利用90K基因芯片技术对硬粒小麦和野生二粒小麦杂交构建的140株小麦群体进行全基因组扫描，共发现14 088个SNPs位点，14个连锁群，构建了全长为2 110 cm的遗传图谱。本研究利用6个已知群体的SNP标记信息，整合了自然群体的24 355个SNP标记的复合遗传图谱，为馒头质构相关性状关联位点提供遗传信息，具有重要价值。

本研究利用24 355个SNP位点以及MLM_Q+K模型对馒头质构性状进行关联分析，在显著水平下检测到较多的关联位点。一方面说明了检测位点较为全面，另一方面也表明了该试验群体的遗传变异较为丰富。此外，环境因素对作物基因的表达有重要的影响，关联位点的表达可分为两类，一类为环境间特异性表达，另一类为多种环境下稳定表达。本实验设置了4个不同环境E1、E2、E3、E4，并将在两个及以上环境中表达的关联位点定义为相对稳定的关联位点。通常，关联分析结果中显著性较大的位点与性状的关联度较高，假阳性的概率低，因此，本实验将显著性较大的位点(p<0.000 1)定义为极显著关联位点。相对稳定关联位点与极显著关联位点都对研究馒头质构性状有较大的意义，可有效地发掘馒头质构性状相关基因。

4 结论

利用24 355个SNP标记对205种小麦粉馒头的质构性状进行全基因组关联分析，结果检测到31个与质构性状极显著关联的位点，单个关联位点的遗传变异贡献率为8.93%～25.14%，11个相对稳定关联位点，5个主效关联位点，分布在小麦21条染色体中的15条。其中，主效关联位点Kukri_c13329_800同时与4个性状存在关联。这些标记的获得可用于小麦标记辅助育种的选择，以及为从基因方面对馒头各品质进行全面研究做铺垫。